2. METHODOLOGY
2.7. Data Analysis
En los 9 loci microsatélite seleccionados para realizar este trabajo, un cebador de cada pareja (cebador directo o “upper”) incorporaba una molécula de fluorocromo de entre tres posibles: 6-FAM, TET y HEX, para permitir la posterior detección del fragmento amplificado. El diseño hacía posible la amplificación y análisis conjunto de los 9 microsatélites mediante PCR múltiple (o multiplex). Para ello se optimizó una mezcla de reacción y un programa de amplificación que se muestran en el apartado de Resultados y Discusión.
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador PTC-100 de MJ Research.
3.2.3.2. Determinación del tamaño de los alelos de los STMS Se realizó esencialmente de acuerdo a Borrego et al. (2000). Tras la PCR se comprobó si se había producido la amplificación. Para ello se tomaron alícuotas de 7µl y se sometieron a electroforesis a temperatura ambiente en geles de agarosa al 2% (p/v) con tampón TAE 1X y bromuro de etidio (0,5µg/ml), aplicando una
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diferencia de potencial aproximada de 5V/cm. Además de las muestras, se incorporó en un pocillo de cada peine el marcador de peso molecular: 0,5µg de ADN del fago φX174 digerido con la enzima de restricción HaeIII.
El siguiente paso consistió en la separación y el análisis de fluorescencia de los microsatélites en el secuenciador ABI PRISM 310 con el software GeneScan (Applied Biosystems) empleado en este analizador genético. El ABI PRISM 310, es un secuenciador semiautomático. La electroforesis se lleva a cabo en el interior de un capilar donde las muestras se separan individualmente, a través de un polímero comercial ya preparado (POP4, de Applied Biosystems).
Cada muestra procedente de la amplificación mediante PCR, se diluyó con agua entre diez y cien veces de acuerdo a la intensidad de fluorescencia observada en el gel de agarosa al 2%. A 1µl de la dilución se le añadieron 20 µl de formamida y 0,2 µl de un marcador de peso molecular: TAMRA 500 (Applied Biosystems). Esta mezcla se sometió a un tratamiento de calor (95ºC, 5 minutos) en el termociclador PTC-100 de MJ Research para desnaturalizar el ADN.
Las muestras así preparadas se sometieron a electroforesis capilar en el ABI PRISM 310, a una diferencia de potencial de 15.000 voltios y a 60ºC de temperatura. Próximo al extremo final, el capilar presenta una ventana transparente que, convenientemente alineada con el láser, permite excitar los fluorocromos que van pasando a través de la misma. Un lector del aparato detecta el paso de las moléculas de ADN a través de la fluorescencia emitida, cuya intensidad es almacenada.
Tras la electroforesis, cada STMS se identificó por el color y el tamaño con el que aparecieron. Este color depende de dos factores: el fluorocromo que lleva incorporado el cebador en cada caso y el filtro utilizado para detectar la fluorescencia. El filtro adecuado para estos fluorocromos es el “C”, que da lugar a los siguientes colores: azul (para el fluorocromo 6-FAM), verde (para TET), amarillo (para HEX) y rojo (para TAMRA).
Los datos brutos de intensidad de fluorescencia se recogieron en el programa informático ABI PRISM 310 Collection. Posteriormente, se analizaron con el software GeneScan. El análisis se realizó muestra a muestra, y comenzó por seleccionar manualmente los fragmentos o picos del marcador incorporado en cada una de ellas. En nuestro caso, TAMRA 500, se marcaron los picos correspondientes
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acuerdo a las instrucciones del fabricante y al rango de los tamaños de los fragmentos amplificados.
El método recomendado y que se siguió para asignar el tamaño molecular del producto de amplificación se llama “Local Southern”. Los tamaños de los fragmentos amplificados, se calculan a partir de una recta de regresión entre los tamaños de los fragmentos del marcador de peso molecular y el tiempo de “elución” de los mismos (tiempo en el que pasan por el lector de la fluorescencia, menor cuanto menor es el tamaño). Como resultado de este proceso, no se obtienen valores enteros (que es lo esperable al medir el tamaño de los fragmentos de ADN, formados por un número determinado de nucleótidos) sino números reales con dos decimales. Estos valores expresados en números decimales, en el estudio de Homogeneidad y Estabilidad, se incorporaron a la base de datos de Access mencionada con anterioridad.
En ocasiones se observó que uno o varios de los nueve microsatélites no amplificaron correctamente. Cuando esto ocurrió, se procedió a repetir la PCR para los mismos, de manera individual, o en conjunto. Si aún así no amplificaban correctamente, se procedió a la amplificación de la muestra diluyendo la solución de ADN, normalmente a una concentración de 1/10, para de este modo disminuir la concentración de posibles impurezas que pudieran estar interfiriendo negativamente en la reacción de PCR. Si después de esta dilución no se obtenía amplificación, lo que se hizo fue proceder a una nueva extracción del ADN de las muestras afectadas.
3.2.3.3. Categorización de alelos para los estudios de Distinción e Identificación
Este proceso es necesario para construir una tabla de genotipos, que posteriormente sería de utilidad para llevar a cabo los estudios de Distinción e Identificación varietal.
Debido a que los valores obtenidos para cada alelo de cada locus microsatélite analizado mediante el Software GeneScan, venían expresados con decimales, para ciertos estudios hubo que ajustarlos a los correspondientes números enteros (que corresponden idealmente a los pares de bases de los alelos). Para ello se usaron unas tablas de rangos previamente definidas en el laboratorio
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de Biología Molecular de la Finca El Encín, en las cuales se detalla una lista de valores enteros (alelos) para cada locus, y a la vez, para cada uno de ellos, dos valores GeneScan que corresponden a los valores máximo (rango inicio) y mínimo (rango fin) obtenidos para el mismo durante el análisis en el ABI PRISM 310 de un amplio número de ADN. En la Tabla M25 se muestra un ejemplo de los valores obtenidos para varios alelos del locus VVMD27, que es uno de los microsatélites empleados en este trabajo.Tabla M25.Rangos correspondientes a varios alelos del locus VVMD27.
Estas tablas de rangos se obtuvieron realizando el proceso de categorización de alelos, en inglés “allele binning” o “allele calling”, que consiste en clasificar los valores obtenidos con GeneScan en diferentes categorías o “bins”, de manera que se incluyeran en la misma categoría aquellos valores que correspondieran al mismo alelo real. Para ello no se redondeó directamente el valor GeneScan al entero más próximo, sino que se llevó a cabo siguiendo esencialmente el algoritmo descrito por Ghosh et al. (1997).
Dependiendo del microsatélite, el resultado obtenido como consecuencia de aplicar el algoritmo fue definitivo o no. En algunos casos fue necesario un ajuste manual, para el que se tuvieron en cuenta los valores de desviación estándar y el tipo de repetición de los diferentes loci empleados, así como otros elementos de interés. A veces, también fue necesario obtener nuevos valores GeneScan para tomar una decisión.
Este proceso de“allele binning” se realizó durante el desarrollo del proyecto VALOR ENTERO
(ALELO) RANGO INICIO RANGO FIN
166 166,08 166,27 173 172,37 173,45 176 175,83 177,13 178 177,86 179,42 180 179,89 181,13 182 181,79 183,26 184 183,35 184,89 186 185,86 187,40 188 188,01 189,00 191 190,41 191,85 198 198,02 198,12
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vid de ‘El Encín’ mediante marcadores moleculares: microsatélites (STMS)”, desarrollándose la tabla de rangos inicial utilizada aquí para transformar valores GeneScan en números enteros asignándoles el valor de la categoría a la que corresponden.
Durante el estudio para evaluar la Distinción, se tuvieron que crear nuevas categorías debido a que hubo muestras de Briones que presentaron valores de alelos que no encajaron en ninguna de las categorías ya existentes.