Data analysis techniques for empirical corroboration

Con el objetivo de obtener una explicación a nivel molecular de los cambios de regioselectividad observados para la β-galactosidasa Biolacta en presencia de algunos disolventes verdes se decidió realizar un estudio de interacción enzima-disolvente mediante modelado molecular, docking y dinámica molecular.

Para ello se construyó un modelo tridimensional de la β-galactosidasa de S. pneumoniae (98%de homología encontrada en el apartado 4.1.3.1.) en presencia de estos disolventes

verdes y el sustrato donador (pNF-β-Gal) y aceptor (GlcNAc) fueron situados en el centro activo de este modelo. Posteriormente se llevaron a cabo dinámicas moleculares en presencia y en ausencia de disolventes y se compararon los resultados entre ellas.

4.1.5.1. Centro activo de la β-galactosidasa de Biolacta

El centro activo fue localizado usando una combinación de la secuencia de la enzima, alineamiento estructural y un docking ciego. El modelo de la enzima reveló que el centro activo podría ser similar al de E. coli (lacZ). La superimposición de la estructura de un monómero y el modelo utilizado llevaron a la identificación del par de aminoácidos del centro catalítico, siendo éstos: Glu-564 y Glu-645, con este proceso se consiguió también determinar el comportamiento químico de cada uno de ellos: el residuo Glu-564 corresponde con el residuo Glu-537 de LacZ el cual está actualmente aceptado como nucleófilo.260 _{Mientras que el residuo Glu-564 fue identificado como el ácido catalítico,}

este hecho es concordante con los primeros resultados de docking.

Figura 35. Modos de unión de la enzima con sustratos en el centro activo: a) a la izquiera modo

poco profundo con un sistema de agua-GC8, a la derecha simulación en modo profundo realizada en agua.

Se observó que el sustrato tiende a localizarse cerca del aminoácido Glu-645, orientado sobre el residuo de Trp-708. Este tipo de interacciones han sido ampliamente investigadas,283 _{y se ha identificado como crucial para otras galactosidasas. Las}

interacciones adicionalescon los residuos His-450, His-484, Asn-563 y Glu-716 contribuyen a estabilizar la molécula tal y como se puede ver en la Figura 35.

Después de modelar el complejo sustrato-enzima, (utilizando para ello el pNF-β-Gal) se realizó el docking de GlcNAc en el centro activo de la enzima. Se seleccionó la mejor solución para este docking como punto de inicio para simular las dinámicas moleculares. Las distancias entre el carbono anomérico (C1) y los hidroxilos 4 y 6 (O4 y O6) de la molécula del aceptor, se confirmaron como indicadores validos de la mejor posición para ser atacada y correlacionada con la regioespecificidad de varias enzimas utilizadas en la síntesis de carbohidratos.178 _{Con este objetivo, se midieron las distancias entre C1, los}

grupos O4 y O6, los átomos de oxígeno de Glu-564 y los protones de cada grupo hidroxilo.

Se prestó especial atención a la información estructural del centro activo, en especial por el modo de unión diferencial entre las simulaciones, entre el O-4 y el O-6 del GlcNAc hacia el C1 del donador, lo que podría explicar el cambio en la regioselectividad mostrado por la enzima cuando se coloca el disolvente, pasando de formar enlaces de tipo β(1→4) a β(1→6). Las distancias medias se presentan en la tabla 26 junto con el RMSD (del inglés “root mean square deviation” que significa raíz media de desviación de los cuadrados,) de los carbonos alfa.

Tabla 26. Distancias medias (Å) entre el carbono anomérico (C1) y los grupos hidroxilos (O4 y

O6) y valores RMSD de la simulación.

C1-O6 C1-O4 COO-_{-HO-C6 COO}-_{-HO-C4 RMSD C}

α (Å)

Agua 5.76a _5.26a _5.73a _5.81a _2.27

GC8-agua 4.79 7.89 7.42 8.93 1.93

a _{Despues de cambiar de posición.}

La tabla 26 muestra que las distancias entre el carbono anomérico de la galactosa del sustrato donador (pNF-β-Gal) y el oxígeno del carbono 6 se reducen cuando hay una mezcla de GC8 disuelto en agua, respecto al medio acuoso, donde la distancia más corta es la del O-4 del GlcNAc y el C-1 del donador. Estas mediciones confirman los datos obtenidos en la síntesis química con las enzimas de biolacta.

4.1.5.2. Simulación en agua

Inicialmente el docking realizado en medio acuoso tamponado mostró una clara preferencia por el O6, siendo este resultado incompatible con el dato experimental, ya que la enzima bajo estas condiciones prefiere el O4. Sin embargo, durante las simulaciones de dinámica molecular, las distancias desde el carbono anomérico al O4 y el O6 cambian a los 700 ps, indicando una variación en la configuración del aceptor. En efecto, se observó un nuevo modo de unión, en el cual el aceptor se encuentra más profundo dentro del centro activo, interactuando principalmente con los residuos: Tyr- 624 y Lis-664.

Este cambio que favorece el ataque del O-4 del aceptor hacia el C-1 del donador, podría ser una consecuencia de efecto de empuje que ejerce el agua debido a la naturaleza hidrofóbica de la cadena de acetilo presente en el GlcNAc, la cual parece interactuar con el residuo de Tyr-624. La distancia entre el C-1 del donador y el O-4 del GlcNAc se encontró más favorable, aunque el O-6 permanece lo suficientemente cerca como para permitir la formación de enlaces, de esta forma la enzima favorece los enlaces β(1→4) y puede sintetizar también β(1→6), tal y como ocurre experimentalmente.

4.1.5.3. Simulación de GC8-agua

En el caso de la mezcla de reacción que contiene GC8 en disolución acuosa, el docking coincide con el producto experimental (Gal-β(1→6)-GlcNAc). El donador muestra durante toda la simulación una clara preferencia por el O-6 del aceptor, favoreciendo la formación del enlace β(1→6). Sin embargo, se encontró una interacción clave presente en este complejo: el residuo Ser-648 interactúa con el grupo hidroxilo O-4 del aceptor. Esta interacción no está presente en la simulación realizada con agua debido al modo de unión de la molécula y esto podría contribuir a la estabilización de complejo. En este caso la cadena de acetilo no ejerce un efecto de empuje sobre el aceptor. Aparentemente, la interacción con el disolvente no es desfavorable como ocurrió con el agua, y la molécula adopta un modo de unión poco profundo con las mismas interacciones que en esencia ocurren en el modo profundo (Tyr-624 y Lys-664) con la interacción adicional con el residuo de Ser-648.

Las distancias medidas durante la dinámica molecular están correlacionadas con los resultados experimentales, en los cuales la formación del isómero β(1→6) es mayoritario en presencia de la mezcla de GC8 (2M)-H2O, mientras que el isómero β(1→4) se obtiene

como producto principal en las reacciones llevadas a cabo en medio acuoso. En la superimposición de ambas estructuras del docking (H2O y GC8-H2O, Figura 36) se puede

apreciar que los oxígenos involucrados en la reacción poseen las distancias apropiadas para llevar a cabo el ataque nucleofílico hacia el C-1 (ubicado en residuo catalítico Glu- 564), en el caso del sistema acuoso, el O4 se sitúa a 5.26 Å y el O6 del sistema GC8-H2O

a 4.79 Å).

Figura 36. Superimposición de los dos modos de unión: poco profundo en verde y profundo en

amarillo. Los residuos catalíticos se muestran en celeste. Se pueden observar la superimposición del O6 (poco profundo) y O4 (profundo)

Los efectos del aceptor en la síntesis de disacáridos han sido descritos antes,58 _{y se ha}

demostrado que éste puede afectar el producto final de la reacción. Particularmente, algunos grupos presentes en el aceptor podrían facilitar el acercamiento del sustrato a los residuos catalíticos e inducir un cambio en la conformación del azúcar. Este es el caso del grupo 2-acetamido presente en el GlcNAc sobre el cual se han determinado importantes influencias en la regioselectividad de la reacción en general, ya que puede afectar la orientación del aceptor dentro del centro activo y limitar su ataque nucleofílico debido a problemas de repulsión estérica.58, 284 En el presente estudio, la interacción entre el grupo acetilo del GlcNAc y el disolvente parecen ser los principales factores que desencadenan

un cambio en el modo de unión en los cuales las moléculas pueden alcanzar una posición adecuada para realizar el ataque nucleofílico en el centro activo, mejorando la accesibilidad de grupos O-4/O-6 y con ello la regioselectividad del proceso.