Data collection and analysis

El aislamiento de leptospiras depende del material elegido y la etapa de la enfermedad. Durante la fase leptospirémica (desde el día 1 hasta alrededor del día 10 después de la presentación de los síntomas) el material más apropiado es la sangre. En el Anexo 16 se brinda información sobre el medio de cultivo apropiado.

A 12.1 SANGRE

La sangre debe ser cultivada dentro de los 10 primeros días de la enfermedad y antes de que se suministren antibióticos. Se obtiene sangre venosa mediante una técnica aséptica e, idealmente, al lado mismo de la cama del paciente, se la inocula en botellas de cultivo para sangre conteniendo medio de cultivo para Leptospira. Inóculos pequeños consistentes de unas pocas gotas de sangre se inoculan en varios tubos, cada uno conteniendo 5 ml de medio apropiado. Inóculos grandes pueden inhibir el crecimiento de las leptospiras.

Los cultivos deben ser incubados a 30°C y revisados regularmente por un período de 4 - 6 meses.

A 12.2 LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO

Las leptospiras se pueden observar con microscopio de campo oscuro (ver Anexo 6) y aislarse por cultivo inoculando 0,5 ml de líquido cefalorraquídeo en 5 ml de cultivo semisólido durante las primeras semanas de la enfermedad.

A 12.3 ORINA

Durante la fase de leptospiruria, caracterizada por un incremento en la concentración de anticuerpos, (una semana después de la presentación de los síntomas) la orina y el cortex renal post mortem (ver abajo) son los inóculos más apropiados para el aislamiento de leptospiras en los humanos. Animales silvestres y domésticos en el estado de portadores pueden liberar leptospiras intermitentemente por muchos años o incluso por toda la vida, durante el cuál las leptospiras pueden ser aisladas de su orina o tejido renal (ver debajo).

Se obtiene orina fresca de la mitad del chorro y se inocula inmediatamente. Una gota de orina no diluida se inocula en el primer tubo conteniendo 5 ml de medio de cultivo. Alternativamente, la muestra de orina puede centrifugarse (30 minutos a 1600 g o 1 minuto a 10 000 g) y el pellet resuspenderse en medio, después de lo cuál se realizan diluciones seriadas 10x en 1 ó 2 tubos adicionales. El cultivo se procesa igual a como se hace con la sangre.

Debido a que la orina es ácida, lo que decrece la viabilidad de las leptospiras, esta debe ser inoculada en el medio de cultivo dentro de las 2 horas después de ser excretada. Se ha reportado un incremento de la viabilidad en muestras de orina neutralizadas con bicarbonato de sodio y con el uso de una solución tamponada de seroalbúmina bovina fosfato (BSA) (Ellinghausen, 1973).

El medio conteniendo 5-fluorouracil o antibióticos apropiados que inhiben el crecimiento de contaminantes bacterianos y no afectan las leptospiras (ver Anexo 16) pueden ser útiles para la reducción de la contaminación de cultivos de orina.

A 12.4 MATERIAL POST MORTEM

En casos fatales de leptospirosis de humanos y animales, los organismos pueden ser cultivados a partir de muestras postmortem maceradas provenientes de varios tejidos. Las leptospiras también pueden ser aisladas exitosamente de fetos de animales abortados. Un trozo de tejido se coloca en una jeringa estéril sin aguja y se exprime (colocando presión en el émbolo) a través del orificio al final de la jeringa hacia un tubo conteniendo medio de cultivo. Alternativamente, una parte del hígado o riñón se colocan en un mortero, junto con tampón de fosfato salino (PBS), pH 7,2 o en medio, y se macera, y la suspensión resultante se inocula en el medio de cultivo.

El procedimiento es como sigue:

1. Corte un pedazo de tejido (0,5 x 0,5 cm) en pequeños trozos en una caja de Petri bajo condiciones de esterilidad.

2. Macere finamente los trozos cortados de tejido en 1 ml de medio de cultivo EMJH estándar (ver pp. 113-115).

3. Coloque 0,5 ml de la mezcla de tejido macerado y medio de cultivo en un tubo conteniendo 5 ml de medio EMJH enriquecido con 1% de suero de conejo y 1% de suero de ternero (FCS) mas 5 fluorouracil (5 FU) y otros 0,5 ml en un tubo conteniendo 5 ml de EMJH estándar más 5 FU. 4. Mezcle los contenidos y transfiera 0,5 ml con una pipeta estéril a otro tubo conteniendo 5 ml de

medio EMJH enriquecido mas 5 FU y medio estándar de EMJH más 5 FU.

5. Mezcle los contenidos y repita el paso 4 de forma que de obtener dos diluciones en tres tubos de medio EMJH enriquecido mas 5 FU y en medio estándar de EMJH mas 5 FU.

6. Incube estos 6 tubos a 30°C y examine el crecimiento una vez por semana por las primeras dos semanas y después una vez cada dos semanas hasta los 4 - 6 meses.

El aislamiento de leptospiras depende del número de organismos viables presentes en el momento de la inoculación en el medio de cultivo. Cambios post-mortem pueden reducir rápidamente el número de organismos viables. Esta reducción en el número de organismos viables depende también de la temperatura. Las leptospiras pueden sobrevivir a 4 °C por algún tiempo pero mueren rápidamente en tejidos mantenidos a 20°C y aún más rápido entre 30 y 40 °C debido a la autolisis de las células y la consecuente disminución del pH. Los tejidos no deben ser congelados, ya que también se reduce la viabilidad de las leptospiras presentes.

REFERENCIAS

Ellinghausen, H.C. Growth temperatures, virulence, survival, and nutrition of leptospires. Journal of

Medical Microbiology, 6:487-497, 1973.

Bibliografía

Babudieri, B. Laboratory diagnosis of leptospirosis. Bulletin of the World Health Organization, 24:45-58, 1961.

Ellis, W.A., Little, T.W.A., Eds. The present state of leptospirosis diagnosis and control. Dordrecht, Boston, Lancaster, Martinus Nijhoff Publishers, 1986.

Faine, S., Adler, B., Bolin, C., Perolat, P. Leptospira and leptospirosis. 2nd _{ed. Melbourne MediSci, 1999.} Levett, P.H. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews, 14: 296-326, 2001.

ANEXO 13