Data Processing Algorithms

Es un sistema por el cual se pretende simular el flujo sanguíneo in vitro, y de esta manera estudiar las interacciones celulares que intervienen en la cascada inflamatoria.

Se sembraron células HUVEC, obtenidas como se describió en el pto 3.2, a 200.000-300.000 células en placas de 35mm precubiertas con fibronectina (20 µgr/mL) durante 1h a 37ºC. Al día siguiente, se estimularon durante 6 h con 20ngr/mL TNF-α a 37ºC. Los neutrófilos (1x106 cels/mL) se obtuvieron de donantes sanos (pto. 3.1), y se resuspendieron en HBSS con 0,5% de albúmina de suero bovino a 4ºC.

Para los estudios de interacción de neutrófilos-HUVEC se utilizó el siguiente material y sistema:

• Jeringas de 20mL (B/BRAUN, Alemania).

• Bomba de succión (Harvard apparatus, Massachusetts, USA).

• Equipo calefactor (Warner Instrument Corporation).

• Microscopio invertido de contraste de fases de fluorescencia (Zeiss, Axiovert, Alemania).

• Bomba de vacío.

• Un sistema de captación de imágenes (Hamamatsu, Orca, Japón).

• Cámara de flujo (Glycotech, Maryland, USA), con una goma (ancho de canal: 5 mm y de grosor: 0,2 mm).

La solución celular se inyectó en la cámara de flujo a presión de 4 dinas/cm2. La interacción celular se visualizó, usando un objetivo 10x del microscopio invertido de contraste de fases, en tres campos diferentes (cada uno de 1 mm2). El sistema de captación de imágenes, una cámara digital conectada al microscopio, se usó para realizar videos a 20 Hz (20 imágenes/seg). Las imágenes se grabaron en un ordenador mediante un programa específico (Wasabi, Hamamatsu, Japón).

Para experimentos con fluorescencia, los neutrófilos se preincubaron con DHE (50µM) durante 15 min a 37ºC, se lavaron con HBSS. Posteriormente,

se resuspendieron en HBSS con 0,5 % de BSA. Se realizaron videos a 20Hz durante 3 min en fluorescencia roja.

8.1 Análisis.

El análisis del rodamiento de neutrófilos sobre el endotelio activado se realizó con un programa de análisis de imágenes (Metamorph, CA, USA). Se calculó el número de células, la distancia, el tiempo y la velocidad con la cual los neutrófilos rodaban sobre las células endoteliales. Para analizar videos de fluorescencia se realizó una kimografía siguiendo la trayectoria de cada neutrófilo, determinándose el nivel de fluorescencia mediante la intensidad de pixeles.

9. DETECCIÓN ROS.

La medición de radicales libres se realizó mediante el DHE. Este producto es sensible a la oxidación, el hidroetidio se transforma en etidio, se intercala en el ADN y emite fluorescencia. El nivel de fluorescencia de las células cargadas con DHE es proporcional a la concentración de ROS intracelular. Los neutrófilos (2x106 cels/mL) se preincubaron con 15 µM de DHE en HBSS durante 15 minutos a 37ºC. Luego, estas células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos (75µL/pocillo), cubiertas con albúmina (1% de albúmina en PBS), en la ausencia y presencia de PMA (20ngr/mL) y diferentes AINE. La intensidad de fluorescencia celular se midió en un fluorímetro (Spectrafluor Genios, Tecan, Austria) con una longitud de onda de excitación de 535 nm y emisión de 610nm, cada 3 min durante 30 min.

9.1 Análisis.

La intensidad de fluorescencia se representó en una escala lineal donde el eje X representa el tiempo y en el Y la intensidad de fluorescencia. De estas curvas se analizó el área que hay bajo ellas de cada una de las condiciones, se

restó a todos los valores el valor del basal y posteriormente se expresó en porcentajes, donde el PMA se consideró 100% y el medio 0%.

10. INMUNOFLUORESCENCIA.

Las inmunofluorescencias se realizaron sobre células sembradas en cámaras de cultivo de 8 pocillos cubiertos con fibronectina (20µgr/mL) durante 1 hora a 37ºC. Las células se fijaron con 3,7% de paraformaldehído (Panreac, Barcelona, España), durante 10 min a temperatura ambiente, y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) durante 5 min a temperatura ambiente. Los lugares de unión inespecífica se bloquearon con 10% suero de cabra (Sigma-Aldrich) durante una 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente con el anticuerpo primario diluído en PBS con 10% de suero de cabra. Después de cinco lavados con PBS e incubados con el anticuerpo secundario Alexa 488 cabra anti-ratón (Molecular Probes, Oregon, USA) durante 45 min a temperatura ambiente, se lavaron y se montaron en medio de montaje FITC- Guard (Testog Inc, Chicago, USA). Posteriormente, se observaron con un microscopio confocal (Olympus, Hamburgo, Alemania).

11. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA.

Neutrófilos humanos no activados y los procedentes de una ventana de piel después de la fagocitosis de esferas de latex, se fijaron durante 24 h en 0,1 M de tampón PHEM (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 2 mM MgCl2, y 10 mM

EGTA (pH 6.9) con un 4% paraformaldehido, y luego fueron procesadas por criosección ultrafina (168). Las criosecciones (45 nm) se cortaron a -125°C usando un lápiz de diamante ₍Drukker Cuijk, Amsterdam, Holanda₎ en un ultramicrotomo (Leica Aktiengesellschaft, Solms, Alemania) y se transfirieron, con una mezcla de sacarosa y metilcelulosa, sobre una rejilla de cobre (169). Las rejillas se plantaron en discos de 35-mm conteniendo 2% gelatina. Para doble inmunomarcaje, se utilizó proteína A de 10 y 15 nm de diámetro (170) conjugada con una sonda de oro coloidal (EM Laboratorio, Universidad de

Utrecht, Países Bajos). Después del inmunomarcaje, las criosecciones se sumergieron en una mezcla de metilcelulosa y uranilacetato y se examinaron con un microscopio electrónico (Philips CM10, California, USA). Los controles negativos se prepararon por reemplazamiento de los anticuerpos por un anticuerpo de ratón o conejo irrelevante.Los anticuerpos usados para el doble inmunomarcaje fueron: anticuerpo monoclonal ratón anti-ADAM-8 humano (R&D Systems); el anti-lactoferrina humana de conejo (Cappel Laboratorios, Detroit, USA); anti_-mieloperoxidasa humana de conejo (DakoCytomation); anti- gelatinasa humana de conejo (171), cedido por Dr. N. Borregaard (Departamento de Hematología, Hospital Universitario National, Copenage, Dinamarca); y anti-albúmina humana de conejo (Central Laboratory, Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Paises Bajos).

12. FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR_.

Los neutrófilos no activados y activados (3–5 x 108) se lisaron y las fracciones postnucleares se fraccionaron continuamente en gradientes de sacarosa de 15%–40% (peso/peso) (172). Las fracciones subcelulares se analizaron por marcaje específico de proteínas para cada organela: la lactato deshidrogenasa (citosol), HLA (membrana plamástica), la fosfatasa alcalina (vesícula secretora), gelatinasa (gránulos terciario), lactoferrina (gránulos especificos), y peroxidasa (gránulos azurofílicos) (172, 173). Las vesículas secretoras no se separaron de la fracción de la membrana plasmática bajo las condiciones de fraccionamiento usadas (173). Las membranas de cada fracción se obtuvieron por dilución de estas fracciones con 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 100 mM NaCl. Luego se centrifugaron a 45.000 rpm (100.000 X g) durante 90 min a 4°C, usando un rotor tipo 70 Ti (B eckman Instruments, CA, USA). Finalmente, los precipitados se resuspendieron en 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), conteniendo 2 mM del inhibidor de proteasas, PMSF (fenilmetanesulfonilfluorido o fenilmetilsulfonil fluorido), y se conservaron a - 20°C hasta su uso.

Tanto los experimentos de microoscopía electrónica como los de fraccionamientos subcelular se realizaron por el Dr. Mollinedo del Centro de Investigación del Cáncer, Consejo Superior de Investigaciones Científicas- Universidad de Salamanca, Salamanca.

13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Los resultados se expresaron como medias aritméticas ± ES de la media. Los análisis de Test de Wilcoxon y de Pearson por pareja de muestras, se usaron para determinar la diferencia significativa entre las medias.

RESULTADOS

1. La expresión de la selectina-L en neutrófilos se regula por un factor