CHAPTER 3: CAMPAIGNS, PROJECTS, REPORTS AND POLICIES
3.5 Databases
ensayos DSB
Después de la identificación y caracterización de los productos generados por DSBs sobre la región MsH42, nos propusimos buscar moléculas cuyo origen fuese los procesos recombinatorios catalizados por la maquinaria de recombinación presente en el extracto nuclear. Para detectar estas moléculas tanto en el ensayo DSB estándar como en el realizado sin Mg2+, purificamos los fragmentos de DNA resultantes del ensayo DSB obtenidos del de agarosa (Figura 30). Este DNA fue utilizado como molde en amplificaciones con los cebadores PS1 y PS2, que se encuentran en los extremos del sustrato f42P. Si obteníamos productos de PCR que conservaran las secuencias del extremo del fragmento f42P al amplificarlo con PS1/PS2 y si eran de menor peso molecular que el fragmento original, entonces deberían ser moléculas recombinantes. En estas amplificaciones, el DNA procedente de las bandas N1, N2, N4 y N5 generó productos con el tamaño correspondiente a cada banda, indicando que además de moléculas DSB, en esas bandas de DNA existen moléculas recombinantes. Sin embargo, este procedimiento únicamente
______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________
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se usó como método de detección de estas moléculas recombinantes, y sus productos no fueron clonados ni secuenciados puesto que podrían generarse artefactos durante la PCR por uniones de extremos imperfectas o
jumping PCR (Pääbo et al., 1990). Para
determinar la secuencia de los recombinantes, se clonaron directamente los productos de los ensayos DSB, estándar y sin Mg2+, en el vector pGEM- 3Z linearizado con PstI. De esta forma, sólo aquellos productos que mantuviesen intactos sus extremos PstI podrían ligarse en el vector y, puesto que el DNA purificado es de menor tamaño que el sustrato f42P original, deberían ser recombinantes. Con esta estrategia se obtuvieron varios clones positivos cuya secuenciación reveló la presencia de
delecciones que oscilan entre 34 y 678 pb con respecto al fragmento original (Figura 37). De forma llamativa, 12 de las moléculas recombinantes presentaban tramos cortos de homología a ambos lados del punto de corte (Figura 37), sugiriendo que su formación estuvo guiada por microhomologías.
Nos planteamos analizar si el mecanismo mediante el cual se estaban originando estos recombinantes precisaba de nueva síntesis de DNA, lo que indicaría que podrían estarse formando por mecanismos como HR o SSA. Para ello
añadimos dCTP marcado radiactivamente a ensayos DSB estándar
y sin Mg2+, con el fin de determinar si el sistema era capaz de realizar dicha síntesis de novo. El análisis de los
MsH42 P P GAGGCTGGGAGAG TGGG Recombinantes aislados en ensayos con Mg2+ GGA GG GAG GCTGGGAGAGGCTGGGAGAG TTGCTG CTGGGAG GCTGGGAGAG 283 pb 168 pb 199 pb 487 pb 160 pb 286 pb 436 pb 407 pb 238 pb 289 pb GGGA GCTGGGAGAGGCTGGGAGAGCTG Recombinantes aislados en ensayos sin Mg2+ G 178 pb 34 pb 678 pb 508 pb MsH42 P P
Figura 37. Recombinantes obtenidos en el ensayo DSB. El esquema representa el conjunto de las moléculas recombinantes obtenidas tanto en presencia como en ausencia de Mg2+, empleando extracto
nuclear de testículo y el fragmento f42P (parte superior) como sustrato. Los recombinantes se muestran a escala con respecto a la región minisatélite. Las líneas punteadas denotan delecciones (se indica su tamaño) en la molécula recombinante con respecto al sustrato f42P original. Las cajas indican zonas de homología, cuya secuencia se muestra, flanqueando el punto de corte.
____________________________Resultados y Discusión________________________
________________________________________________________________ 99 productos de estos ensayos mostró que
los fragmentos DSB aparecían marcados en la reacción estándar (Figura 38), demostrando que efectivamente el nucleótido marcado se estaba incorporando al DNA en nuestro sistema
in vitro. Por el contrario, no se observó
marcaje en las reacciones sin Mg2+, lo que se puede explicar por la dependencia de este catión por parte de las DNA polimerasas. Aunque el extracto era capaz de realizar síntesis de DNA, todavía restaba por establecer si ésta era necesaria para la formación de las moléculas recombinantes detectadas en nuestro ensayo. Para ello realizamos experimentos en los que se eliminaron los dNTPs del tampón DSB, a la vez que se adicionaban ddNTPs, que bloquean la síntesis de DNA. La ausencia de incorporación de dCTP en el ensayo DSB puso de manifiesto que, bajo estas condiciones, la síntesis de novo está bloqueada (Figura 38), pero el patrón de bandas DSB fue igual al obtenido en condiciones estándar. El hecho de que se pudiesen obtener recombinantes a partir de los productos de los ensayos con y sin Mg2+ en condiciones en que la síntesis de DNA está fuertemente inhibida, es una sólida evidencia de que los procesos de síntesis de DNA no están implicados en la generación de, al menos, parte de las moléculas recombinantes originadas durante el ensayo DSB. El marcaje que detectamos en la reacción estándar era probablemente debido al relleno de extremos 3´-recesivos producidos por exonucleasas (Mason et al., 1996) o por procesos de nick translation.
Si consideramos conjuntamente que para la formación de recombinantes no se requiere síntesis de DNA, la presencia de delecciones en la gran mayoría de las moléculas recombinantes y la existencia de secuencias homólogas cortas a ambos lados del punto de corte, podemos concluir que la HR no parece ser el mecanismo de formación de los
Sin Mg 2+ - dN TPS + ddN TPs F std
f42P
f42P
Figura 38. Síntesis de DNA en el ensayo DSB. Se realizaron una serie de experimentos donde se incorporó dCTP en ensayos DSB en condiciones estándar (std), en reacciones sin Mg2+ (-Mg2+) o en reacciones sin dNTPs y
con ddNTPs (-dNTPs / +ddNTPs). F, fragmento f42P sin extracto. El panel superior muestra el gel teñido con bromuro de etidio y el inferior la autorradiografía obtenida a partir del mismo gel.
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recombinantes detectados en nuestro ensayo, ya que ésta se caracteriza por la implicación de síntesis de novo de DNA y por dar lugar a productos recombinantes que son normalmente iguales a los originales. La actividad que da lugar a las moléculas recombinantes sería diferente a las descritas anteriormente en otros ensayos in vitro, donde sí se ha constatado el concurso de eventos de síntesis de DNA para la generación de moléculas recombinantes (Singleton & Jeggo, 1999; Pospiech et al., 2001). Las delecciones y la presencia de secuencias duplicadas a ambos lados del DSB podrían hacer pensar en mecanismos del tipo SSA (Göttlich et al., 1998) o NHEJ guiado por microhomologías (Boulton & Jackson, 1996) como responsables de la generación de los recombinantes detectados, pero la ausencia de requerimiento de síntesis de DNA descartaría en principio al primero de estos procesos. Por lo tanto, el modelo que mejor se ajusta a nuestras observaciones es el NHEJ, que se encontraría facilitado por pequeñas regiones de homología en las secuencias adyacentes al punto de generación del DSB. La naturaleza repetitiva de nuestra secuencia haría especialmente efectiva esta forma de recombinación, ya que la similitud entre las unidades repetitivas de MsH42 e incluso determinados motivos ricos en guanina de las secuencias adyacentes permite múltiples opciones de emparejamiento homólogo. No podemos descartar, sin embargo, que puedan estar ocurriendo otro tipo de
procesos recombinatorios que hayan pasado inadvertidos en nuestro análisis. El sistema que acabamos de describir nos ha permitido el estudio de la generación de DSBs en la región MsH42 y de la formación de moléculas recombinantes por NHEJ. Hemos visto como los extractos nucleares poseen actividades endonucleásicas capaces de producir DSBs en un fragmento que comprende a la región MsH42 en condiciones tanto de presencia como de ausencia del catión Mg2+. La principal actividad endonucleásica en condiciones estándar muestra una gran preferencia por secuencias ricas en guanina y todos los indicios de que disponemos apuntan a que tal enzima es la endonucleasa G. La actividad independiente de Mg2+ parece deberse a un enzima distinto de la endonucleasa G, pero que no hemos sido capaces de identificar. Además, hemos detectado eventos recombinatorios en este mismo ensayo DSB, caracterizados esencialmente por la no necesidad de síntesis de DNA, por la aparición de delecciones en los recombinantes y por la presencia de regiones cortas de homología flanqueando a las delecciones en la mayoría de ellos. Estas propiedades apoyan la premisa de un mecanismo de tipo NHEJ favorecido por microhomologías como el responsable de la formación de las moléculas recombinantes observadas. Todo este conjunto de datos puede permitirnos explicar los resultados obtenidos anteriormente en nuestro laboratorio acerca de la capacidad recombinogénica de MsH42.
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