3.5 Decoder Error Probability
3.5.2 DEP with Erasures
Conclusiones
Las líneas con resistencia derivada de L. hirsutum y L. chilense presentaron menores síntomas de infección.
Los híbridos entre líneas resistentes X líneas susceptibles tuvieron altos rendimientos pero la calidad de sus frutos no fue optima.
Los híbridos entre líneas resistentes tuvieron una mayor resistencia y rendimiento. La resistencia en todas las líneas, es al menos parcialmente dominante y los sistemas de genéticos de resistencia son complementarios.
Existió una correlación directa entre la presencia de síntomas y el rendimiento.
Hubo una correlación directa entre la presencia de síntomas y la concentración de ADN viral.
Recomendaciones
Continuar el proceso de selección hasta la obtención de líneas que incorporen las características requeridas por las condiciones locales de producción y comercialización. Realizar pruebas de los híbridos con los mejores frutos en campos comerciales.
Realizar cruces entre las mejores líneas resistentes con líneas de frutos firmes con el objetivo de formar nuevos híbridos que puedan ser transferidos a los productores de inmediato.
Utilizar el rendimiento y la concentración de ADN viral como los principales criterios en la selección de plantas resistentes.
Mantener una vigilancia estricta sobre la inminente introducción de TYLCV al territorio nacional y sobre sus posibles consecuencias.
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34 Mapear la introgresión de L. hirsutum en el genoma del tomate.
BIBLIOGRAFÍA
Abouzid, A.M., Polston, J.E., Hiebert, E. 1992. The nucleotide sequence of tomato mottle virus, a new geminivirus isolated from tomato in Florida. J. Gen. Virol. 73:3225-3229. Accotto, G.P., Vaira, A.M., Noris, E. & Vecchiati, M. 1998. Using non-radioactive probes on plants: a few examples. J. Biolumin. Chemilumin. 13:1-7.
Bellows, T.S., Perring, T.M., Gill, R.J. & Headrick, D.H. 1994. Description of a species of Bemisia (Homoptera:Aleyrodidae infesting North American agriculture. Ann. Entomol. Soc. Am. 87:195-206.
Brown, J. K. 1994. Current status of Bemisia tabaci as a plant pest and virus vector in agroecosystems worldwide. FAO Plant Prot. Bull. 42:3-32.
Brown, J.K. & Bird, J. 1992. Whitefly-transmitted geminiviruses and associated disorders in the Americas and the Caribbean basin. Plant Dis. 76:220-225.
Brown, J.K., Frohlich, D.R., Rosell, R.C. 1995. The sweetpotato or silverleaf whiteflies: Biotypes of Bemisia tabaci or a species complex? Annu. Rev. Entomol. 40:511-534. Czosnek, H., Ver, R., Navot, N. & Zamir, D. 1988. Detection of tomato yellow leaf curl virus in lysates of plants and insects by hybridization with a viral DNA probe. Plant Dis. 72:949-951.
Czosnek, H. & Laterrot, H. 1997. A worldwide survey of tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142:1392-1406.
Dellaporta, S.L., Wood, J. & Hicks, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21.
Flor, H.H. 1946. Genetics of pathogenicity in Melamspora lini. J. Agric. Res 74:335- 337.
Friedmann, M., Lapidot, M., Cohen, S., & Pilowsky, M. 1998. A novel source of resistance to tomato yellow leaf curl virus exhibiting a symptomless reaction to viral infection. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 123:1004-1006.
Gilbertson, R.L., Hidayat, S.H., Martinez, R.T., Leong, S.A., Faria, J.C., Morales, F.J. & Maxwell, D.P. 1991. Differentiation of bean-infecting geminiviruses by nucleic acid hybridization probes and aspects of bean golden mosaic in Brazil. Plant Dis. 75:336-342. Gómez, O. 1998. La lucha genética también forma parte del manejo integrado de plagas del tomate. AgriCultura 1(9):54-58.
Resistencia genética del tomate. Informe final
Proyecto FODECYT 11-00
Resistencia genética del tomate. Informe final
Proyecto FODECYT 11-00
36 Goodman, R.M., 1977. Single-stranded DNA genome in a whitefly-transmitted plant virus. Virology 83:171-179.
Kaloo, G. & Banerjee, M.K. 1990. Transfer of tomato leaf curl virus resistance from Lycopersicon hirsutum f. glabratum to L. esculentum. Plant Breeding 105:156-159. Lapidot, M., Friedmann, M., Lachman, O., Yehezkel, A., Nahon, S., Cohen, S., &
Pilowsky, M. 1997. Comparison of resistance level to tomato yellow leaf curl virus among commercial cultivars and breeding lines. Plant Dis. 81:1425-1428.
Lastra, R. 1993. los geminivirus: un grupo de fitovirus con características especiales. En: Hilje, L. & Arboleda, O. (Eds.). Las Moscas Blancas (Homoptera: Aleyrodidae) en América Central y El Caribe. Memorias del Taller Centroamericano y del Caribe sobre Moscas Blancas. Serie Técnica, informe Técnico No. 205. CATIE, Costa Rica. p16-19. Laterrot, H. 1990. An EEC programme to improve the resistance of the tomato to tomato yellow leaf curl virus. EUCARPIA, Tomato Working Group, Synopses XIth meeting, March, 1990, Malaga, Spain. p31-36.
Laterrot, H. 1992. Resistance genitors to tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Tomato Leaf Curl Newsletter 1:2-4.
Laterrot, H. 1996. Breeding strategies for disease resistance in tomatoes with emphasis on the tropics: current status and research challenges. Proc. 1st Int. Conference on the processing Tomato. Nov. 1996, Recife, Brazil. p126-132.
Laterrot, H. & Moretti, A. 1996. Chepertylc lines. Tomato Leaf Curl Newsletter 8:4. Martínez, J. 2001. Tomato markets in Central America. Tomato Breeder’s Round Table. Antigua, Guatemala (12-16 de marzo).
Martínez, Y., Quiñónez, M., Fonseca, D., Potter, J. & Maxwell, D.P. 2002. First report of tomato yellow leaf curl virus associated with beans, Phaseolus vulgaris, in Cuba. Plant Disease 86:814.
Mejía, L., Teni, R. E., Nakhla, M. K., & Maxwell, D. P. 1998. Tomato-infecting whitefly- transmitted geminiviruses in Guatemala. 2nd International Workshop on Bemisia and geminiviral diseases. Puerto Rico, June 7-12, 1998. p. P47.
Mejía, L. 1999. Evaluación de genotipos de tomate para resistencia a geminivirus transmitidos por mosca blanca y su detección por PCR. Informe Final. Proyecto FODECYT 48-97. 52p.
Mejía, L. 2001. Mejoramiento genético del tomate para resistencia a virus géminis transmitidos por mosca blanca y su detección por hibridación de ácidos nucleicos. Informe Final. Proyecto FODECYT 83-99. 41p.
Resistencia genética del tomate. Informe final
Proyecto FODECYT 11-00
37 Mejía, L. 2001a. Resistencia genética al acolochamiento de la hoja para la producción sostenible del tomate. AgriCultura 4 (41):31-33.
Mejía, L., Friedmann, M., Lapidot, M., Pilowsky, M., Vidavski, F., Czosnek, H. & Maxwell, D. 2001. Evaluation of tomato germplasm resistant to TYLCV for resistance to bipartite whitefly transmitted geminivruses in Guatemala. 41st Annual Meeting of the American Phytopathological Society-Caribbean Division (APS-CD). Varadero, Cuba.
Mejía, L., Teni, R.E., Czosnek, H., Vidavski, F., Bettilyon, A., Nakhla, M.K. & Maxwell, D.P. 2002. Field evaluation of tomato experimental lines and hybrids for resistance to begomoviruses in Guatemala. Phytopathology 92:S54.
Michelmore, R. W., Paran, I., & Kesseli, R. V. 1991. Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions using segregating populations. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9828-9832.
Morales, F. J. & Anderson, P. K. 2001. The emergence and dissemination of whitefly- transmitted geminiviruses in Latin America. Arch. Virol. 146:415-441.
Nakhla, M.K., & D. P. Maxwell. 1998. Epidemiology and management of tomato yellow leaf curl disease. In Plant Virus Disease Control, ed. by A. Hadidi, R. K. Khetarpal, and H. Koganezawa. Published by APS Press . pp.565-583.
Nakhla, M. K., Maxwell, D. P., Martinez, R. T., Carvalho, M. G., & Gilbertson, R. L. 1994. Widespread occurrence of the Eastern Mediterranean strain of tomato yellow leaf curl geminivirus in tomatoes in the Dominican Republic. Plant Dis. 78:926.
Navas-Castillo, J., Sanchez-Campos, S., Diaz, J.A., Saenz-Alonso, E & Moriones, E. 1999. Tomato yellow leaf curl virus-Is causes a novel disease of common bean and severe epidemics in tomato in Spain. Plant Dis. 83:29-32.
Padidam, M., Sawyer, S. & Fauquet, C.M. 1999. possible emergence on new geminiviruses by frequent recombination. Virology 265:218-225.
Pico, B., Diez, M.J. & Nuez, F. 1999. Improved diagnostic techniques for tomato yellow leaf curl virus in tomato breeding programs. Plant Dis. 83:1006-1012.
Pilowsky, M. & Cohen, S. 1974. Inheritance of resistance to tomato yellow leaf curl virus in tomatoes. Phytopathology 64:632-635.
Pilowsky, M. & Cohen, S. 1990. Tolerance to tomato yellow leaf curl virus derived from Lycopersicon peruvianum. Plant Dis. 74:248-250.
Resistencia genética del tomate. Informe final
Proyecto FODECYT 11-00
38 virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses in tomato. Plant Dis. 83:984-988.
Polston, J. E., & Anderson, P. K. 1997. The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in tomato in the Western Hemisphere. Plant Dis. 81:1358-1369.
Potter, J.L. 2001. PCR and DNA hybridization methods for specific detection and identification of bean-infecting geminiviruses. Tesis de Maestria. University of Wisconsin- Madison.
Ramírez, P. & Maxwell, D.P. 1994. Geminivirus transmitidos por moscas blancas. En: de Mata, M., Dardón, D.E. & Salguero, V.E. (Eds.) Biología y manejo del complejo mosca blanca-virosis. Memorias del III Taller Centroamericano y del Caribe sobre Mosca Blanca (Guatemala, septiembre, 1994). p.95-108.
Rojas, M. R., Gilbertson, R. L., Russell, D. R., & Maxwell, D. P. 1993. Use of degenerate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly-transmitted geminiviruses. Plant Dis. 77:340-347.
Roye, M.E., Wernecke, M.E., McLaughlin, W.A., Nakhla, M.K., & Maxwell, D.P. 1999. Tomato dwarf leaf curl virus, a new bipartite geminivirus associated with tomatoes and peppers in Jamaica and mixed infection with tomato yellow leaf curl virus. Plant Pathol. 48:370-378.
Salguero, R. 1994. Análisis del complejo mosca blanca-virosis en tomate. In: Mata, M., D.E. Dardón and V.E. Salguero (Eds.) Biología y Manejo del Complejo Mosca Blanca- Virosis. Memorias del III Taller Centroamericano y del Caribe sobre mosca blanca (Guatemala, 19-23 de septiembre, 1984). P.16-22.
Scott, J. W. & Schuster, D. J. 1991. Screening of accessions for resistance to the Florida tomato geminivirus. TGC Report 41:48-50.
Scott, J. W., Stevens, M. R., Barten, J. H. M., Thome, C. R., Polston, J. E., Schuster, D. J., & Serra, C. 1996. Introgression of resistance to whitefly-transmitted geminiviruses from Lycopersicon chilense to tomato. In Bemisia 1995: Taxonomy, Biology, Damage, Control and Management, ed. by D. Gerling and R. T. Mayer, Intercept Ltd., pp. 357- 367.
Ueno, A., Sanchez, A., Teni, R.E., Mejía, L. & Maxwell, D.P. 2002. Detección de ADN viral y su concentración en líneas progenitoras de tomate tolerantes y susceptibles a geminivirus transmitidos por mosca blanca y sus híbridos. 42ª Reunión de la Sociedad Americana de Fitopatología-División Caribe y 5º Seminario de Manejo Integrado de Plagas en Cultivos no Tradicionales de Exportación.
Resistencia genética del tomate. Informe final
Proyecto FODECYT 11-00
39 Vidavsky, F., & Czosnek, H. 1998. Tomato breeding lines resistant and tolerant to tomato yellow leaf curl virus issued from Lycopersicon hirsutum. Phytopathology 88:910- 914.
Wyatt, S.D. & Brown, J.K. 1996. Detection of subgroup III geminivirus isolates in leaf extracts by degenerate primers and polymerase chain reaction. Phytopathology 86:1288-1293.
Zakay, Y., Navot, N., Zeidan, M., Kedar, N., Rabinowitch, H., Czosnek, H. & Zamir, D. 1991. Screening of Lycopersicon accessions for resistance to tomato yellow leaf curl virus: presence of viral DNA and symptom development. Plant Dis. 75:279-281.
Zamir, D., Ekstein-Michelson, I., Zakay, Y., Navot, N., Zeidan, M., Sarfatti, M., Eshed, Y., Harel, E., Pleban, T., van-Oss, H., Kedar, N., Rabinowitch, H.D. & Czosnek, H. 1994. Mapping and introgression of a tomato yellow leaf curl virus tolerance gene, TY-1. Theor. Appl. Genet. 88:141-146.
APENDICES
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APÉNDICE 1-1. EXTRACCIÓN DE ADN
Extracción de ADN de células vegetales por el método Dellaporta modificado (Rojas et al., 1993. Plant Dis. 77:320-347).
Obtener una cantidad pequeña de tejido (dos a tres discos de tejido fresco o congelado obtenidos con un sacabocados #4, 5mg de tejido seco).
1. Agregar 250ul de buffer de extracción Dellaporta:
150ul BME (beta mercaptoetanol) (a una concentración final de 10mM) 5ml 1 M Tris pH 8.0 (a una concentración final de 100mM) 5ml 0.5 M EDTA pH 8.0 (a una concentración final de 50mM) 5ml 5 M NaCl (a una concentración final de 500mM) 34ml H2O
50ml total
Homogenizar el tejido usando un pistilo KontesTM. Agregar 250ul mas de buffer Dellaporta y mezclar.
2. Agregar 33ul de SDS al 20% (10 g/50 ml H2O), invertir el tubo y mezclar. Incubar a 65º durante 10 min.
3. Agregar 160ul de acetato de potasio (245g KOAc/500ml H2O), vortex, centrifugar durante 10 min. a 10,000-12,000 rpm.
4. Transferir 500 a 600ul de sobrenadante a un tubo limpio. Agregar 160ul de 5M KOAc, vortex, centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min. Transferir 700ul de sobrenadante a un nuevo tubo.
5. Agregar 0.5 volumen (350ul) de isopropanol frio. Mezclar bien y centrifugar durante 10 min. A 12,000 rpm.
6. Con mucho cuidado remueva el sobrenadante.
7. Lavar la pastilla con 500ul de etanol al 70%, centrifugar durante 5 min. A 12,000 rpm. Elimine el sobrenadante por decantado.
8. Secar al aire durante 1 hora.
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APÉNDICE 1-2.EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO VEGETAL POR CALOR.
Obtener una cantidad pequeña de tejido (dos a tres discos de tejido fresco o congelado obtenidos con un sacabocados #4, 5mg de tejido seco).
Agregar 500ul de buffer de extracción Dellaporta (ver Apéndice 1-1).
Para tejido seco: dejar en hielo durante alrededor de 20 min. En 500ul buffer Dellaporta. Homogenizar el tejido usando un pistilo KontesTM.
Incubar a 95ºC durante 5 min.
Colocar los tubos en hielo durante 5 minutos Centrifugar durante 10 min. a 14,000 rpm. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
Diluir 1:10 y 1:100 para PCR. Usar sin diluir para hibridación. Almacenar a -20ºC.
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APÉNDICE 1-3.PROCEDIMIENTO PARA PCR.
Ajustar la concentración de los primers a 10uM. Para preparar un primer de un tubo liofilizado, centrifugar el tubo brevemente. Obtener la concentración del primer en nanomoles y multiplicar por diez. Agregue esa cantidad de agua doble destilada (por ejemplo, a un primer de 72nm se agregan 720ul de agua). Vortex durante diez minutos, invirtiendo el tubo dos a tres veces. Esta es una solución 10X. De la solución 10X, diluya una fracción 1:10 para obtener una concentración de 10uM para PCR (por ejemplo, tomar 10ul de la solución 10X y agregar 90ul de agua). Mezclar bien y almacenar a -80ºC.
Cada mezcla de reacción para PCR debe contener lo siguiente por cada mezcla 25ul:
13.9ul ddH2O
2.5ul 2.5mM dNTP (25ul de cada nucleótido en 900ul de dH2O)
2.5ul buffer 10X (proporcionado por el proveedor de la Taq polimerasa) 2.5ul MgCl2 (proporcionado por el proveedor de la Taq polimerasa) 0.1ul Taq polimerasa
0.5ul de cada uno de los primers viral y complementario a una concentración de 10uM Las Ready-to-Go PCR BeadsTM (Amersham Pharmacia) contienen en forma liofilizada todos los ingredientes anteriores excepto el agua y los primers, de manera que la cantidad de agua que se agrega es de 21.5ul a cada tubo.
Agregar 2.5 de ADN a cada tubo (10-20ng de ADN obtenido por el método Dellaporta). Para algunos tipo de termociclador es necesario agregar dos gotas de aceite mineral en cada tubo.
Parámetros del ciclo de PCR para la amplificación de geminivirus: Para 30 ciclos Para el ultimo ciclo Denaturación: 94ºC por 1 min. 94ºC por 1 min. Unión: 55ºC por 2 min. 55ºC por 2 min. Extensión: 72ºC por 2 min. 72ºC por 7 min.
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APÉNDICE 1-4.PREPARACIÓN DE LA MEMBRANA PARA HIBRIDACIÓN
Colocar 5ul de ADN de cada muestra en una membrana de nylon (Hybond-N+; Amersham Pharmacia).
Lísis de la membrana
En un recipiente de vidrio tipo pirex, saturar tres capas de papel filtro Whatman 3MMTM con NaOH 0.5N (20ml de NaOH 5N + 180ml H2O). Remover el exceso. Colocar las membranas, lado del ADN hacia arriba, sobre el papel filtro saturado; no crear burbujas o dobleces. Dejar por 3 min. (Saturar el papel filtro nuevamente antes de lisar otro juego de membranas).
Transferir las membranas a un recipiente con Tris 1M pH 7.4. Dejar por 5 min., agitando ocasionalmente.
Transferir las membranas a un recipiente con SSC 2X (20mol de SSC 20X + 180ml H2O). SSC 20X: Disolver 175.3g de NaCl + 88.2g citrato de sodio en 800ml de H2O. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH 10N. Ajustar el volumen a un litro con H2O. Autoclavear. Dejar en reposo por 5 min. con agitación ocasional.
Transferir las membranas a un recipiente con etanol al 95%. Dejar en reposo por 5 min. con agitación ocasional. El etanol se torna turbio, reemplazar si se lisan varias membranas.
Secar las membranas al aire. Pueden almacenarse durante varios meses en bolsas plásticas, mejor si se hace a 4ºC.
Fijación del ADN a la membrana
Puede hacerse por cualquiera de dos métodos:
Automáticamente, en un horno para fijación por luz UV o manualmente, en un transiluminador UV, exponiendo la membrana durante 3 min.
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APÉNDICE 1-5.HIBRIDACIÓN POR EL MÉTODO ALK PHOS DIRECTTM
Buffer de hibridación (Hyb BufferTM) 0.5M NaCl
4% (w/v) Blocking reagentTM
1. Mezclar 14.61g NaCl con 500ml Hyb buffer hasta que se disuelva totalmente, calentar ligeramente si es necesario.
2. Agregar lentamente 20g de Blocking reagent.
3. Mezclar a temperatura ambiente durante 1-2h en agitador magnético hasta obtener una solución clara.
4. Almacenar en cantidades dispensables a -20ºC hasta por 6 meses. Solución de lavado primario: 500ml
Urea 60g
SDS 0.5g
0.5M NaH2PO4 50ml (fosfato de sodio monobásico, ajustado a pH 7.0 con NaOH 10N)
NaCl 4.35g
MgCl2 1.0M 0.5ml Blocking reagentTM 1g
1. Mezclar urea, SDS, NaCl y blocking reagent en 400ml de H2O hasta la disolución. 2. Agregar MgCl2 y NaH2PO4 y llevar a un volumen final de 500ml.
3. Puede almacenarse durante 1 semana a 4ºC. Solución de lavado secundario 20X: 500ml Tris base 60.5g
NaCl 56g
1. Disolver Tris y NaCl en 450ml H2O.
2. Ajustar el pH a 10.0 con NaOH 10N y llevar a un volumen final de 500ml. 3. Puede almacenarse hasta cuatro meses a 4ºC.
Solución de lavado secudario 1X: 500ml Solución 20X 25ml
dH2O 475ml
MgCl2 1M 1ml
1. Diluir la solución de lavado secundaria 20X 1:20 con dH2O 2. Agregar 1ml de MgCl2 1M por cada 500ml de solución. 3. Esta solución no puede almacenarse.
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46 Notas adicionales:
Usar 22ml de solucion de hibridación por cada 10cm2 de membrana para membranas de 10cm de ancho por 20cm de largo.
Prehibridizar las membranas durante 30min a 1h hasta la saturación completa. Para sondas generales, temperatura de hibridación 55ºC.
Para sondas especificas, temperatura de hibridación 65ºC. Usar 30-40ml de lavado primario, lavar 2X durante 20min.
Usar 100ml de lavado secundario por 10 cm2 de membrana en un recipiente a temperatura ambiente, lavar 2X durante 10 min.
Usar 2ml de detection reagent por 10 cm2 de membrana. Procedimiento Alk Phos DirectTM:
Marcaje de la sonda
1. Diluir el ADN a ser marcado a una concentración de 10ng/ul. Desnaturalizar el ADN diluido en un tubo de micro centrífuga durante 5 min. en baño de agua hirviendo. Enfriar inmediatamente en hielo durante 5 min. Centrifugar brevemente.
2. Agregar 10ul de buffer de reacción al ADN enfriado. Mezclar por pipeteo.
3. Agregar 2ul de reactivo de marcaje (labelling reagent). Mezclar por pipeteo. Este reactivo es el factor limitante al número de sondas que pueden marcarse con el kit por lo que debe conservarse.
4. Agregar 10ul de crosslinker (8ul de agua + 2ul de solución crosslinker). Mezclar bien y centrifugar brevemente.
5. Incubar la reaccion durante 30 min. a 37ºC.
6. La sonda puede almacenarse en hielo por hasta dos horas o hasta 6 meses en glicerol al 50% (v/v) a -20ºC.
Hibridación
1. Precalentar 10ml/cm2 de membrana de buffer de hibridación Alk Phos Direct a una temperatura de 55ºC para baja especificidad (estringency) y 65ºC para alta especificidad.
2. Colocar la membrana en el tubo de hibridación y prehibridizar con buffer de hibridación durante 30 min.
3. Agregar la muestra marcada al utilizado buffer para la prehibridacion (5-10ng de sonda marcada/ml de buffer).
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47 4. Hibridizar toda la noche a la temperatura requerida por el grado de especificidad deseado.
Lavado y detección de la señal
1. Precalentar 2X 50ml de la solución de lavado primario a la temperatura de hibridación.
2. Transferir la membrana a un tubo de hibridación limpio. Lavar 2X durante 20 min. en 50ml de solución de lavado primario.
3. Preparar la solución de lavado secundario. Diluir la solucion basica 1:20 en agua estéril y agregar 2ml/l de MgCl2 1M.
4. Colocar la membrana en un recipiente limpio 2X 10 min. en 100ml de solución de lavado secundario.
5. Drenar el exceso de solución de lavado secundario tocando una esquina de la membrana en la pared del recipiente. Coloque la membrana con el ADN hacia arriba en Saran WrapTM y agregar el reactivo de detección CDP-StarTM en la membrana y dejándolo por 2 min. Usar 2ml de reactivo de detección por cada 10 cm2 de membrana.
6. Drenar el exceso de reactivo de detección y coloque la membrana en nuevo Saran Wrap o fólder de revelado. Inmediatamente cubrir la membrana con la tapa del fólder o segunda hoja de Saran Wrap. Remover cualquier burbuja. Exponer a la película de rayos-X.
7. Exponer la membrana a la película de rayos X en cuarto oscuro. Esperar 4 horas. Revelado de la película de rayos X
Retirar la película de rayos X del folder y sumergirlo en la solución de revelado durante 1-5 minutos con agitación leve.
Lavar con agua.
Colocar en la solución de fijación durante 1-5 minutos, hasta que la emulsión sobre la película desaparezca.
Lavar con agua durante 1-3 minutos. Secar la película a temperatura ambiente.
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APÉNDICE 2. DETECCIÓN DE ADN VIRAL Y SU CONCENTRACIÓN EN LÍNEAS PROGENITORAS
Detección de ADN viral y su concentración en líneas progenitoras e tomate tolerantes y susceptibles a geminivirus transmitidos por mosca blanca (resumen)
Ueno, A., Sánchez, A., Teni, R.E., Mejía, L. & Maxwell, D.P.
Resumen de la presentación en la 42ª. Reunión de la Sociedad Americana de Fitopatología-División Caribe (APS-CD) y 5º. Seminario de Manejo Integrado de Plagas en Cultivos No Tradicionales de Exportación (IPM-CRSP). Antigua, Guatemala 17-19 de junio, 2002.
Se evaluaron dos líneas progenitoras con tolerancia a geminivirus transmitidos por mosca blanca (originados de Lycopersicon hirsutum y L. pimpinellifolium y L. peruvianum, respectivamente) y una susceptible y sus híbridos en Sanarate, Guatemala, bajo alta presión de mosca blanca y sin aplicación de ningún método de control contra este insecto. Se colectaron muestras de hojas de las plantas más afectadas y menos afectadas en cada genotipo a los 45 días después del transplante. El ADN viral fue extraído de estas muestras y se realizo PCR e hibridación dot-blot usando primers generales y una sonda general para determinar la presencia de ADN viral y su concentración. Todas las muestras fueron positivas al análisis por PCR. Sin embargo, la