COMPUTER-AIDED DESIGN FOR RAPID PROTOTYPING
3.1 INTRODUCTION TO CAD MODELING
3.1.1 DESIGN FOR OPTIMIZATION
Los ratones apoE -/-, a los cuales, por manipulación genética, se les ha silenciado el gen que codifica para la apolipoproteína E, constituyen un modelo de incalculable valor para el estudio de las dislipidemias.(18)
En comparación con sus homólogos no modificados, los C57BL/6J, se espera que los ratones apoE -/- desarrollen una hipercolesterolemia severa desde las primeras semanas de vida.(73-75)
En el modelo de dislipidemias en ratones inducida por P338 se observó que la mezcla de sapogeninas ofreció mejores resultados que la FRY y la diosgenina patrón, por lo que se continuó la experimentación solo con el extracto n-butanólico de las hojas de A. brittoniana y la mezcla de sus sapogeninas.
Los resultados obtenidos en el presente estudio aparecen reflejados a continuación, en las tablas 7 y 8.
Como se puede observar los niveles de colesterol son elevados para todos los grupos de ratones apoE -/-. Este resultado coincide con lo esperado pues este tipo de ratones desarrollan la hipercolesterolemia severa desde las primeras semanas de vida.(73, 75)El grupo de ratones C57Bl/6J se emplea como control, para verificar la dislipidemia característica de los ratones apoE -/-.
Tabla 7: Estadísticas descriptivas para el parámetro colesterol en mmol/L para cada grupo experimental. Los valores se expresan como la Media ± DE.
Grupos COLESTEROL (mmol/L)
0 días 7 días 14 días
Saponinas 5,55 ± 1,71b 4,93±0,41a 5,10±0,51b
Sapogeninas 5,87 ± 0,64b 7,77±1,91b 4,92± 2,75b
Atorvastatina 6,12 ± 1,48b 4,54±0,74a 5,04±0,75b
Control sin tto 5,25 ± 0,92b 6,70±0,85b 6,26±1,20b
Control C57BL/6J
2,40±0,52c 2,38±0,12c 3,40±1,32c
Subíndices iguales p>0,05 no existe diferencias significativas, subíndice desigual p0,05 existe diferencias significativas segúntest de Mann Whitney.
Como se puede observar, en el periodo de estudio no se logra la corrección de la hipercolesterolemia hasta niveles fisiológicos del colesterol plasmático. Se observó
44 reducción a los 7 días de tratamiento, en el colesterol plasmático en el grupo tratado con atorvastatina (p=0,035).
Como se puede observar (tabla 8) los niveles de triacilglicéridos al inicio del ensayo se encontraban en valores iguales, desde el punto de vista estadístico para todos los grupos de ensayo.
Tabla 8: Estadísticas descriptivas para el parámetro triacilglicéridos en mmol/L para cada grupo experimental. Los valores se expresan como la Media ± DE.
Grupos TAG (mmol/L)
0 días 7 días 14 días
Saponinas 0,44±0,14c 1,95±0,20b 1,42±0,66a
Sapogeninas 0,62±0,14c 1,33±0,32b 1,84±0,51b
Atorvastatina 0,50±0,16c 1,33±0,17b 1,32±0,76a Control sin tto 0,45±0,02c 1,71±0,11b 3,60±1,00b Control
C57BL/6J
0,40±0,06c 1,24±0,19c 1,23±0,32b
Subíndices iguales p>0,05 no existe diferencias significativas, subíndice desigual p0,05 existe diferencias significativas según test de Mann Whitney.
En los grupos de las saponinas y la atorvastatina, a las dos semanas de administrado el producto, disminuyeron los niveles de triacilglicéridos, significativamente con respecto al grupo control sin tratamiento (p=0, 030 y 0,020 respectivamente; test de t-student), siendo similares a los niveles fisiológicos de los ratones C57BL/6J. No se observó igual comportamiento en el grupo correspondiente a la sapogeninas.
El análisis de la evolución de los parámetros en el mismo grupo se efectuó utilizando test de t-student para muestras pareadas. Se observó disminución significativa de los triacilglicéridos en el grupo de las saponinas una vez terminado el estudio (p=0,035. La reducción de los triacilglicéridos a partir de los 7 días y hasta los 14 días de aplicada la atorvastatina, fue observada (0,032 y 0,02 respectivamente). Los resultados obtenidos en el modelo de los ratones apoE-/-, no son sorprendentes y coinciden con lo obtenido en el modelo agudo del detergente. En este caso las saponinas vuelven a mostrar un efecto reductor sobre los triacilglicéridos. Estudios
45 previos han demostrado que saponinas aisladas de Panax notoginseng mostraron en varios diseños experimentales efecto reductor de lípidos en ratones apoE-/-.(76) En un estudio de mayor duración, en este modelo, probablemente, podríamos observar efectos hipolipémicos de mayor potencia. La bibliografía señala varias investigaciones empleando este biomodelo, donde se prolonga desde seis semanas y hasta seis meses la comprobación del efecto hipolipémico.(77, 78)
Un ejemplo de lo dicho anteriormente es el efecto comprobado por Park, H. J. (2011) para la diosgenina en este tipo de modelo.(79)
Simultáneamente, se realizó el estudio del comportamiento del peso corporal de los ratones en este modelo experimental.
Tabla 7:Valores de peso corporal expresados en gramos, tomados a las 0; 24 y 48 horas, para cada una de las sustancias de ensayo.
t Saponinas Sapogeninas Atorvastatina Control
C57BL/6J Control sin tto
0 23,75±2,5a 21,25±2,5a 21,25±2,5a 25±2,5a 22,5±3,53a
7 20,0±0b 22,5±2,89a 22,5±2,89a 23,75±0a 25,0±0a
14 21,25±2,5a 25,0±7,07a 21,25±2,5a 25,0±0a 25,0±0a
Un ANOVA de una vía mostró reducción significativa a los 7 días de tratamiento del peso corporal. El post hoc de Bonferroni reveló que solamente el grupo de las saponinas disminuyó este parámetro en la primera semana de estudio (p=0,032). Por otra parte la reducción del peso corporal observada en el grupo de las saponinas, coincide con estudios no publicados en modelo de síndrome metabólico, donde la administración diaria durante 14 días de estos metabolitos extraídos de A. brittoniana provocan disminución significativa del peso corporal. Estos resultados se relacionan con el efecto a nivel del tracto gastrointestinal que provocan las saponinas. Es conocido que estas pueden inhibir la absorción de glucosa, colesterol y otros lípidos y de esta manera se disminuye la ingesta calórica y se previene el consecuente incremento de peso corporal.(80)
Delgado Rodríguez, J et al. (2016)(81) en estudios in vitro e in vivo en ratas han evidenciado que las saponinas causan un incremento en la permeabilidad de la
46 mucosa. Se describe que estos hechos provocarían un aumento en la tasa de exfoliación de las células intestinales, asociado a un incremento en la pérdida de colesterol por secreción fecal de ácidos biliares y esteroides neutros, dada la capacidad de las saponinas de unirse al colesterol de la bilis en el intestino causando lisis celular e impidiendo su reabsorción; además, ayudarían en la absorción de medicamentos específicos.(81)
Al igual que en el modelo agudo de inducción por P338, el efecto reductor de los lípidos observado solo en el grupo de las saponinas y no en el de la sapogeninas, pudiera estar relacionado por la variación en los mecanismos de acción que se produce con el cambio estructural de un tipo de metabolito a otro. Las saponinas debido a su naturaleza anfipática forman complejos insolubles con el colesterol, previniendo su absorción en el intestino delgado. Las micelas formadas con las sales biliares pueden tener un tamaño extremadamente grande lo cual también evita la absorción de los lípidos y cualquier sustancia que quede atrapada en esta estructura.(82)Sin embargo las sapogeninas son fácilmente absorbibles en el intestino delgado, lo que determina que su efecto sea a nivel sistémico. Aunque existen pocos estudios que develen el mecanismo de acción por la cual sapogeninas puedan tener efecto hipolipémico, la diosgenina, ha sido evaluada en modelo de ApoE-/- y se ha demostrado que su efecto reductor de lípidos está íntimamente relacionado con su potencial antiinflamatorio e inhibitorio de la expresión de las moléculas de adhesión celular vascular (VCAM siglas en inglés) que con el tiempo contribuyen al desarrollo del proceso aterosclerótico.(79)
Podríamos resumir que las saponinas extraídas de A. brittoniana presentan mayor efecto hipolipémico que las sapogeninas correspondientes en modelos agudos o relativamente cortos. De acuerdo a nuestros resultados y la bibliografía consultada, probablemente estudios que impliquen mayor dosificación en el tiempo, que permitan la expresión de mediadores inflamatorios relacionados con desbalances celulares que contribuyan al desarrollo de las dislipidemias, pudieran corroborar el efecto hipolipémico de estas sapogeninas.
48
Conclusiones
1. Las saponinas junto a los azúcares reductores son los metabolitos presentes en la fracción n-butanólica del extracto hidroalcohólico de las hojas de A brittoniana.
2. Las sapogeninas proveniente del hidrolizado de la fracción n-butanólica del extracto hidroalcohólico de hojas de A brittoniana mostraron resultados promisorios en un modelo in vivo de hiperlipidemia inducida por Poloxamer 338 a la dosis de 50 mg/kg de peso, porque manifestó actividad hipocolesterolémica superior a la atorvastatina. Ninguna de las sustancias estudiadas mostró actividad hipotrigliceridémica en este modelo.
3. En el estudio de la hiperlipidemia con el modelo de ratones apoE-/- se observó, que las saponinas provenientes de la fracción n-butanólica del extracto hidroalcohólico de hojas de A brittoniana, a la dosis de 50 mg/kg de peso, mostraron actividad hipotrigliceridémica similar a la atorvastatina a los 14 días, que se asemejan a los niveles fisiológicos de TAG. Ninguna de las sustancias estudiadas mostraron actividad hipocolesterolémica en este modelo.
4. Las saponinas provenientes de la fracción n-butanólica del extracto hidroalcohólico de hojas de A brittoniana, a la dosis de 50 mg/kg de peso, provocaron pérdida de peso de los ratones apoE-/-.
49
Recomendaciones
Continuar el estudio de los extractos de Agave brittoniana T, en la actividad farmacológica en otros modelos agudos y crónicos de hiperlipidemia.
50
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59
Anexos:
Anexo No 1: Certificado de autorizo de alimento animal usado en el experimento, expedido por el centro suministrador (CENPALAB) y recepcionado en la Unidad de Garantía de la Calidad (UGC) de la UTEX.
60 Anexo No 2: Resultados del tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de A.