Developing suitable pedagogical approaches

incrementa en una l´ınea de linfocitos de rat´on estimulada con factores de creci- miento [105].

En segundo lugar la actividad de estos enzimas puede ser incrementada o disminuida por distintos medios. En algunos casos la modificaci´on postraduc- cional de la propia enzima, como la fosforilaci´on de CBP [106] o la sumoilaci´on de HDAC4 [107] consiguen alterar la actividad enzim´atica. En otras ocasiones las interacciones con otras prote´ınas son las que modifican la actividad HAT o HDAC. Por ejemplo se ha descrito que la actividad HAT de p300/CBP es es- timulada por factores transcripcionales espec´ıficos de secuencia como HNF1-α [108] y Elk1 en su forma fosforilada [109]. Tambi´en la disponibilidad de cofac- tores metab´olicos puede afectar a la actividad, como es el caso de Sir2p. Sir2p, que requiere el cofactor NAD+

, se encuentra relacionada gen´eticamente con al- gunas enzimas de rutas metab´olicas de NAD+

, lo que sugiere que los niveles de acetilaci´on y las redes metab´olicas est´an acoplados [110].

Por ´ultimo, la disponibilidad de los enzimas puede regularse por su capacidad para interaccionar con factores transcripcionales espec´ıficos, que a veces implica el cambio de su localizaci´on subcelular. Un ejemplo t´ıpico de regulaci´on por localizaci´on subcelular es el de la fosforilaci´on de HDACs de tipo II. HDAC5 se fosforila por prote´ına quinasas dependientes de Ca2+_{/Calmodulina (CaMKs)}

para ser relocalizada al citoplasma en un proceso de crucial importancia para la diferenciaci´on muscular [111]. Por otro lado, CBP puede ser metilada por CARM1 (Coactivator ARginine Methyltransferase 1) de modo que disminuye su afinidad por CREB fosforilado, y se encuentra disponible para interaccionar con otros factores de transcripci´on [112].

1.2.2.

Metilaci´on

La metilaci´on postraduccional de las histonas fue descrita hace m´as de cuatro d´ecadas [113, 114], pero las funciones asociadas a esta modificaci´on covalente han permanecido sin desvelar durante mucho tiempo. La metilaci´on de histonas nucleosomales en m ´ultiples residuos y en patrones definidos forman parte del

sistema de se˜nalizaci´on postulado en la hip´otesis del c´odigo de histonas. Esta modificaci´on se lleva a cabo sobre las cadenas laterales b´asicas de arginina y lisina, generalmente de las regiones amino terminales de las histonas H3 y H4, aunque tambi´en se metilan residuos de las zonas globulares.

Las lisinas se pueden mono-, di- y trimetilar por acci´on de histona metiltrans- ferasas (HMTs), mientras que las argininas ´unicamente se pueden monometilar y dimetilar por las prote´ına arginina metiltransferasas (PRMTs). Dentro de las HMTs espec´ıficas de lisinas encontramos la familia SET, que se caracteriza por poseer un dominio SET (Su(Var) Enhancer of Zeste Trithorax). Dot1p es la ´uni- ca HMT que no contiene dominio SET, aunque se ha determinado la estructura cristalina de las enzimas Dot1p de levadura y humanos, observ´andose propie- dades estructurales semejantes a las de las prote´ınas SET, y tambi´en a las de las PRMTs [115, 116]. Por otro lado, la dimetilaci´on de la arginina puede ser asim´etrica o sim´etrica, siendo catalizadas las reacciones por PRMTs de tipo I o de tipo II respectivamente.

La metilaci´on de histonas se hab´ıa considerado una modificaci´on postraduc- cional irreversible hasta muy recientemente. Dos trabajos demostraron que la forma monometilada de la arginina es desmetilada a citrulina por la enzima hu- mana PAD4, lo que dejar´ıa por resolver el problema de la regeneraci´on del resi- duo de arginina para permitir posteriores modificaciones [117, 118]. Asimismo se ha descrito otra enzima humana, LSD1, capaz de desmetilar las formas mono- y dimetiladas de la lisina 4 de la histona H3 a trav´es de una reacci´on redox que genera formaldeh´ıdo [119], regenerando el residuo de lisina que puede volver a ser metilado. Sin embargo, a´un no se han descrito enzimas que desmetilen la forma trimetilada de la lisina.

Hist´oricamente la metilaci´on ha sido vinculada a la represi´on transcripcio- nal y al establecimiento de heterocromatina. Dependiendo del residuo metilado y de su relaci´on con otras modificaciones de la cromatina en su entorno, es- ta modificaci´on se encuentra asociada a una funci´on diferente. Por ejemplo, la metilaci´on de la lisina 9 de H3 se ha relacionado con la formaci´on de hetero- cromatina y la represi´on transcripcional, mientras que la metilaci´on de la lisina

1.2.2 Metilaci´on 41

4 de H3 se asocia a la activaci´on de la transcripci´on g´enica [36]. La heterocro- matina se puede describir estructuralmente como largos segmentos de genoma, enriquecidos en secuencias repetitivas, con baja densidad de genes y con series de nucleosomas de espaciado regular. Adem´as, bioqu´ımicamente estos dominios heterocromat´ınicos se caracterizan por la hipoacetilaci´on de histonas, la metila- ci´on de la lisina 9 de la histona H3, y la metilaci´on del DNA. Sin embargo, la metilaci´on en la lisina 9 no es un marcador de heterocromatina en S. cerevisiae, puesto que no se produce en este organismo. La inactivaci´on del cromosoma X en mam´ıferos, la impronta (imprinting), y el establecimiento de heterocromatina constitutiva son procesos que poseen mecanismos similares a los de la represi´on transcripcional heredable, y que dependen de HMTs con distintas especificida- des.

Por otro lado, la metilaci´on se ha relacionado con la activaci´on de la trans- cripci´on, concretamente en los procesos de inicio y elongaci´on de la transcrip- ci´on. Se ha determinado que los genes activos se hallan metilados en la lisina 4 y 36 de H3, lo que sugiere su participaci´on en la activaci´on g´enica [120, 121]. Seg´un el modelo actual desarrollado a partir de estudios en S. cerevisiae, la mo- noubicuitinaci´on (ver apartado 1.2.3) de la lisina 123 de H2B facilita el recluta- miento de Set1, una HMT espec´ıfica de la lisina 4 de H3 [122]. Esto inducir´ıa la metilaci´on de este residuo y conjuntamente al reclutamiento de Set1, se pro- ducir´ıa el del complejo de elongaci´on Paf1, lo cual coincidir´ıa con la fosforila- ci´on de la serina 5 del dominio carboxilo terminal (CTD) de la RNA polimerasa II [123, 124]. Sin embargo algunos autores han apuntado que la monometilaci´on de la lisina 4 de H3 no se ve afectada por la p´erdida del complejo Paf1, ni por la p´erdida de la monoubicuitinaci´on de la lisina 123 de H2B [125]. A continuaci´on la metilaci´on de K4 de H3 podr´ıa ser seguida de la desubicuitinaci´on de la K123 de H2B por Ubp8p, componente del complejo HAT SAGA [126], lo que permi- tir´ıa el reclutamiento de Set2. Esta segunda HMT metilar´ıa la lisina 36 de H3, lo que coincide con la fosforilaci´on de la serina 2 del CTD y el inicio de la etapa de elongaci´on.

Algunos autores han sugerido que la metilaci´on de histonas en genes activos podr´ıa tener un papel de marcador de larga duraci´on para la propagaci´on del es-

Figura 1.6.Metilaci´on de histonas y activaci´on transcripcional. Se representa la in-

teracci´on entre la fosforilaci´on de los residuos de serina 2 y 5 del CTD de la RNA polimerasa II, la metilaci´on de las lisinas 4 y 36 de H3, y la ubicuitinaci´on de la lisina 123 de H2B. Extra´ıdo de la revisi´on [122].

tado activo tras la divisi´on celular [122]. De hecho, una de las funciones que se le han atribuido a la metilaci´on de histonas es el mantenimiento de la memoria celular de estados transcripcionales activos y reprimidos a lo largo del desarrollo en metazoos. Las prote´ınas tipo SET del grupo Trithorax (TrxG), con actividad HMT sobre la lisina 4 de H3, se han relacionado con la propagaci´on del estado activado [127], mientras que las del grupo Polycomb (PcG), tambi´en con el do- minio SET, median el estado reprimido de la cromatina a trav´es de dos familias de complejos con actividad HMT, los complejos represores PRC1 y PRC2 [128]. La impronta gen´omica es otro de los procesos en los que se halla implicada la metilaci´on de las histonas y en este caso tambi´en la metilaci´on del DNA. En mam´ıferos la impronta consiste en la represi´on monoal´elica de los genes hereda- dos por v´ıa materna o paterna. La detecci´on de metilaci´on de histonas espec´ıficas de alelos en genes con impronta sugiri´o una relaci´on entre ambos procesos [129]. La p´erdida de este fen´omeno en un subconjunto de genes de c´elulas de rat´on de- ficientes en un componente de un complejo Polycomb, apunta a una relaci´on entre el proceso de desarrollo y los complejos remodeladores de la cromatina que dependen de prote´ınas tipo PcG [130].

1.2.2 Metilaci´on 43

La metilaci´on de la lisina 79 en la histona H3 fue la primera de las modifi- caciones postraduccionales localizada fuera del extremo amino terminal de las histonas [131, 132]. Ensayos in vivo han revelado que esta posici´on es necesaria para la correcta formaci´on y mantenimiento de cromatina silenciada en las tres regiones de este tipo que aparecen en S. cerevisiae (tel´omeros, loci de determi- naci´on sexual HMR o HML, y rDNA) [131, 133, 134], a pesar de que la lisina 79 no se encuentra metilada en ninguna de esas regiones. Se ha propuesto un modelo en el que la metilaci´on de la posici´on 79 act´ua previniendo la uni´on de las prote´ınas SIR a las regiones de cromatina activa, o eucromatina. As´ı se ase- gurar´ıa que estos factores SIR se encuentran disponibles para el ensamblaje de estructuras heterocromat´ınicas en las localizaciones adecuadas [135]. El modelo se apoy´o en la observaci´on de que el 90 % de las mol´eculas de H3 en levadu- ra se encuentran metiladas en esa posici´on, y este porcentaje concuerda con la fracci´on de genoma que en ese organismo forma parte de eucromatina [131]. Por otro lado, otro trabajo posterior demostr´o que la metilaci´on de K79 de H3 se pro- duc´ıa a lo largo de las regiones eucrom´aticas del genoma de levadura (asimismo en regiones eucrom´aticas de eucariotas superiores), pero que se halla infrarepre- sentada en heterocromatina [134]. A nivel estructural, esta modificaci´on se ha encontrado en la superficie del nucleosoma, en una regi´on accesible al solvente, la cual se hab´ıa identificado como gen´eticamente importante para la estructura de la cromatina silenciada. Dot1p es la HMT responsable de esta modificaci´on en levadura, y su hom ´ologa hDOT1L ha sido implicada en la desregulaci´on de genes diana de MLL (Mixed Lineage Leukemia) en leucemia.

1.2.2.1. Relaci´on entre metilaci´on y acetilaci´on de histonas

Recientemente se ha sugerido la existencia de una coordinaci´on entre las actividades responsables de la metilaci´on y la acetilaci´on de histonas. Debido a que la metilaci´on del extremo amino terminal de H3 se ha visto implicada en mediar la interacci´on con nucleosomas de diversas actividades HAT y una HDAC, resulta atractivo pensar que la metilaci´on de determinados residuos de H3 pueda servir como transductor universal de la acetilaci´on de histonas [136].

Entre las HATs cuya actividad se ha vinculado con la metilaci´on de H3 se encuentran NuA3 (ver apartado 3.1.1 en p´ag. 64), NuA4, SAGA y SALSA/SLIK. En S. cerevisiae se ha descrito una hipermetilaci´on de la lisina 4 de H3 tras la activaci´on transcripcional de las secuencias UAS (Upstream Activation

Sequence) de GAL1-10. Esta hipermetilaci´on es dependiente de la actividad ubi-

cuit´ın proteasa de Ubp8p, y se piensa que puede estabilizar a´un m´as el recluta- miento de SAGA y SALSA/SLIK [137]. La estabilizaci´on se producir´ıa gracias a la interacci´on de los cromodominios de Chd1, una prote´ına con actividad AT- Pasa y helicasa componente de SAGA y SALSA/SLIK, con la lisina 4 de H3 metilada. Respaldando esta teor´ıa, se ha comprobado que SALSA/SLIK muestra una actividad preferencial sobre p´eptidos amino terminales de H3 dimetilados en la lisina 4 frente a la histona sin modificar [138].

La actividad NuA4 que acetila la lisina 8 de H4 tambi´en se ha visto rela- cionada con la trimetilaci´on de la lisina 4 de H3 y la di- o trimetilaci´on de la lisina 36 de H3. Un estudio mediante inmunoprecipitaci´on de cromatina (ChIP) mostr´o que la asociaci´on de Esa1p, subunidad catal´ıtica de NuA4, al promo- tor activado de MET16, depende de la presencia de Set1 y Spp1 (componen- tes del complejo HMT COMPASS de levadura), y de Set2 [139]. Adem´as, las subunidades Esa1 y Eaf3 de NuA4, contienen cromodominios, y se han detec- tado interacciones gen´eticas entre SET2, EAF1 y EAF2 (componentes tambi´en de NuA4) [140]. Todos estos datos sugieren fuertemente que NuA4 interacciona con los residuos de lisina 4 y 36 de H3 una vez metilados por Set1p y Set2p, respectivamente.

La actividad HDAC Rpd3 de levadura tambi´en se ha visto relacionada con la metilaci´on del extremo amino terminal de H3 [141, 142]. Se han identificado dos complejos Rpd3 seg´un su tama˜no: Rpd3L y Rpd3S. El complejo peque˜no Rpd3S contiene la subunidad Eaf3, la cual posee un cromodominio que permite a Rpd3S unirse a la lisina 36 de H3 metilada. Esta metilaci´on se produce por acci´on de Set2, una HMT asociada a la RNA polimerasa II. Se ha propuesto que la desacetilaci´on por Rpd3 elimina la acetilaci´on asociada a la elongaci´on para evitar inicios intrag´enicos de la transcripci´on [141, 142].