Development of control logic for the solar thermal system

De la colonia electa se amplificó y purificó como se describe en la sección [4.5]. Con el ADN ultrapuro, una vez más se corroboró la presencia del plásmido de interés con la realización de una digestión enzimática, el patrón de restricción resultante se comparó con la restricción de una muestra nativa en un gel de electroforesis.

En la Figura 20, se demuestra que el ADN mutado presenta el patrón de restricción esperado y de ahí se prosiguió a comprobar la presencia de la mutación mediante secuenciación.

Plásmido nativo sin cortar Marcador 10000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 6000 2000 1500 750 500 8000 6000 5000 1800 Plásmido mutado sin cortar Plásmido nativo cortado Plásmido mutado cortado

Figura 20. Gel de agarosa al 0.8% que muestra los mapas de restricción del plásmido control y el mutado. Carril 1: ADN nativo sin cortar. Carril 2: ADN mutado sin cortar. Carril 3: Marcador de peso molecular. Carrirles 4 y 5: ADN nativo y mutado cortados con la enzima BamHI.

5.8 Secuenciación y alineamiento múltiple.

Para la comprobación de la mutación, se preparó una muestra del plásmido pS64T-hH1 (hNav 1.5) mutado y se mandó a secuenciar al Instituto de Biotecnología de la UNAM, lo que se obtuvo fue una secuencia de 700 bases aproximadamente, la cual fue alineada con el mismo segmento de ADN que codifica para el canal nativo, en el programa bioinformático Clustal Omega disponible de manera gratuita en línea. En la figura 21 se puede apreciar, que el único cambio que se generó fue el codón TTC por el codón GCT marcados en azul y amarillo respectivamente.

hNav1.5 TATGTCAAGTGGGAGGCTGGCATCGACGACATGTTCAACTTCCAGACCTTCGCCAACAGC FwF1760A TATGTCAAGTGGGAGGCTGGCATCGACGACATGTTCAACTTCCAGACCTTCGCCAACAGC ************************************************************ hNav1.5 ATGCTGTGCCTCTTCCAGATCACCACGTCGGCCGGCTGGGATGGCCTCCTCAGCCCCATC FwF1760A ATGCTGTGCCTCTTCCAGATCACCACGTCGGCCGGCTGGGATGGCCTCCTCAGCCCCATC ************************************************************ hNav1.5 CTCAACACTGGGCCGCCCTACTGCGACCCCACTCTGCCCAACAGCAATGGCTCTCGGGGG FwF1760A CTCAACACTGGGCCGCCCTACTGCGACCCCACTCTGCCCAACAGCAATGGCTCTCGGGGG ************************************************************ hNav1.5 GACTGCGGGAGCCCAGCCGTGGGCATCCTCTTCTTCACCACCTACATCATCATCTCCTTC FwF1760A GACTGCGGGAGCCCAGCCGTGGGCATCCTCTTCTTCACCACCTACATCATCATCTCCGCT ********************************************************* hNav1.5 CTCATCGTGGTCAACATGTACATTGCCATCATCCTGGAGAACTTCAGCGTGGCCACGGAG FwF1760A CTCATCGTGGTCAACATGTACATTGCCATCATCCTGGAGAACTTCAGCGTGGCCACGGAG ************************************************************ hNav1.5 GAGAGCACCGAGCCCCTGAGTGAGGACGACTTCGATATGTTCTATGAGATCTGGGAGAAA FwF1760A GAGAGCACCGAGCCCCTGAGTGAGGACGACTTCGATATGTTCTATGAGATCTGGGAGAAA ************************************************************ hNav1.5 TTTGACCCAGAGGCCACTCAGTTTATTGAGTATTCGGTCCTGTCTGACTTTGCCGACGCC FwF1760A TTTGACCCAGAGGCCACTCAGTTTATTGAGTATTCGGTCCTGTCTGACTTTGCCGACGCC ************************************************************ hNav1.5 CTGTCTGAGCCACTCCGTATCGCCAAGCCCAACCAGATAAGCCTCATCAACATGGACCTG FwF1760A CTGTCTGAGCCACTCCGTATCGCCAAGCCCAACCAGATAAGCCTCATCAACATGGACCTG ************************************************************ hNav1.5 CCCATGGTGAGTGGGGACCGCATCCATTGCATGGACATTCTCTTTGCCTTCACCAAAAGG FwF1760A CCCATGGTGAGTGGGGACCGCATCCATTGCATGGACATTCTCTTTGCCTTCACCAAAAGG ************************************************************ hNav1.5 GTCCTGGGGGAGTCTGGGGAGATGGACGCCCTGAAGATCCAGATGGAGGAGAAGTTCATG FwF1760A GTCCTGGGGGAGTCTGGGGAGATGGACGCCCTGAAGATCCAGATGGAGGAGAAGTTCATG ************************************************************ hNav1.5 GCAGCCAACCCATCCAAGATCTCCTACGAGCCCATCACCACCACACTCCGGCGCAAGCAC Fenilalanina Alanina

FwF1760A GCAGCCAACCCATCCAAGATCTCCTACGAGCCCATCACCACCACACTCCGGCGCAAGCAC ************************************************************ hNav1.5 GAAGAGGTGTCGGCCATGGTTATCCAGAGAGCCTTCCGCAGGCACCTGCTGCAACGCTCT FwF1760A GAAGAGGTGTCGGCCATGGTTATCCAGAGAGCCTTCCGCAGGCACCTGCTGCAACGCTCT ************************************************************

Una vez que se comprobó la introducción de la mutación en el canal hNav 1.5, se probó el efecto de la mutación en la actividad del canal, mediante la inyección en ovocitos de Xenopus laevis y la comparación de la biofísica con el canal nativo (esto fue realizado por Coyotl, cuyos resultados se muestran en los anexos 1 y 2).

6 Discusión

Un gran número de experimentos mutagénicos se han llevado a cabo para dar evidencia sobre el principal sitio de unión a anestésicos locales (AL), los cuales han mostrado la importancia de una variedad de residuos aminoacídicos encontrados en los dominios I, III y V, dentro de los que el aminoácido F1760 que se encuentra en el segmento 6 del domino IVS6 (para la isoforma hNav1.5b) ha sido considerado el residuo crítico al que se unen dichos fármacos, los cuales pueden bloquear el poro dependiendo del estado funcional en el que se encuentre el canal. Teniendo evidencia sólida de la importancia de éste aminoácido, ha sido el principal residuo que se ha mutado generalmente por otro aminoácido con propiedades químicas distintas; es por eso que la mutación F1760A ya se ha reportado para el estudio molecular y biofísico así como para la caracterización de nuevos agentes químicos que han mostrado tener algún efecto de bloqueo sobre canales de sodio (Ragsdale et al., 1994; Nau et al., 2000; Yarov-Yarovoy et al., 2002; O’Reilly et al., 2012).

La mutación en el sitio de unión a AL ya se ha realizado en la isoforma Nav1.4 en el laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular del Centro de Química-BUAP, obteniendo la mutante Nav1.4/F1579A (Sánchez, 2015) usada para estudios biofísicos. Por lo que para la generación de la mutación en el mismo sitio de AL en

Figura 21. Alineamiento múltiple de la secuencia nativa del gen que codifica a Nav1.5 y la secuenciación del ADN plasmídico mutado, donde se visualiza el cambio esperado del codón TTC por el codón GCT.

la isoforma Nav1.5 se siguieron las especificaciones que incluye el manual del kit QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis (Stratagene). Sin embargo, se presentaron diversos problemas para la obtención de la mutante, así, en el primer intento se obtuvieron falsos positivos, por lo que se optó por hacer algunas modificaciones al protocolo anteriormente utilizado y rediseñar nuevamente los oligonucleótidos. Al realizar un segundo análisis bioinformático del primer par de oligonucleótidos desfasados y tomando en cuenta que el codón a mutar se encuentra en una región con secuencias en tándem, se encontró que el cambio del codón que se estaba realizando, introducía en ambos oligos, estructuras secundarias altamente estables en sus extremos 3’ al involucrar la C y la A del codón GCA (Ala), esto, desde la primera etapa de la PCR, ya que el ∆G de la formación de tales estructuras, es negativo, es decir, espontánea. Aunando todo esto al hecho de que la polimerasa pfu tiene actividad exonucleasa, esta misma se encargaba de quitar esos extremos 3’ incorrectos (que se encontraban cerca del codón Ala) y repolimerizaba a la secuencia complementaria “correcta”, es decir, volvía a introducir el codón para Fenilalanina en lugar del codón de Alanina, lo que explica la obtención de falsos positivos.

Para evitar de nueva cuenta que se generaran estructuras secundaias en los oligonucleótidos, fue que se cambió el diseño como se muestra en el apartado [5.2] a oligonucleótidos complementarios con el codón GCT que igual codifica para una Alanina.

Hasta este punto se puede ver que sin importar el tipo de mutación a realizar en cualquier gen, el diseño de los oligonucleótidos que introducirán la mutación es el paso crítico para la obtención exitosa de una mutagénesis, ya que si desde el inicio se pone atención en cada aspecto molecular de los procesos, el resultado sale de manera casi inmediata.

Otro inconveniente detectado para lograr una mutagénesis fue el encontrar la Tm adecuada para la realización de la PCR de punto final para introducir la mutación a pesar de que la empresa que sintetiza los oligonucleótido manda sus características, se ha visto de manera empírica que no siempre resulta ser óptima

la Tm especificada; por lo que se realizó una PCR en gradiente a cinco temperaturas diferentes, cuyo resultado visualizado en la figura 15, permitió elucidar la mejor temperatura de alineamiento para la PCR de punto final. Además se usó otra polimerasa, la pfu fushion Green Polimerase en lugar de la pfu polimerasa convencionalmente utilizada, puesto que tiene una más alta fidelidad y una mejor posesividad. Si bien, sólo se obtuvieron 6 colonias transformadas con la reacción de PCR, la experiencia nos ha mostrado que entre menos colonias, hay mayor probabilidad de obtener la mutación.

Si bien se utilizaron las cantidades de plantilla (50 ng) y de oligonucleótidos (10 picomoles) especificados en el kit; no se observó el producto de PCR después de la digestión con la enzima Dpn I. Esto se puede deber a que la PCR para la mutagénesis es de 18 ciclos y no siempre se observa la banda. También es importante mencionar que la región de interés donde se encuentra el sitio de anestésicos locales, contiene secuencias en tándem, lo que dificultó el diseño de los oligonucleótidos mutagénicos. Sin embargo, se continuó con la extracción del ADN plasmídico de todas las colonias y de manera arbitraria se eligió una colonia potencialmente mutada para purificar su plásmido y comprobar la mutación por secuenciación, que como se puede observar en el resultado del apartado [5.8] el único cambio realizado de la secuencia de interés fue el esperado. Aunque claro está que no sólo la secuenciación de la región de interés es la prueba infalible de que la proteína será totalmente funcional, sino que, para el caso de los canales iónicos, se requieren además estudios de electrofisiología que sustenten esas bases. Por lo que otra manera en la que se pudo comprobar el cambio del aminoácido, fue mediante estudios electrofisiológicos preliminares, donde la expresión heteróloga de la proteína mutada fue totalmente funcional, con la única diferencia de que al pasar la solución con lidocaína a una concentración de 269 µM (IC50 reportada por Moreau y cols., 2017) el porcentaje de bloqueo de la corriente de sodio, fue de aproximadamente el 20%, comparado con el efecto de bloqueo que genera el anestésico a la misma concentración sobre la proteína nativa, donde el bloqueo de la corriente es del 50% (véase anexos 1 y 2).

7 Conclusión.

Con este trabajo se logró la obtención de la mutación F1760A en la secuencia codificante para el canal de sodio cardiaco humano (hNav1.5) clonado en el plásmido pSP64T, esto con el diseño adecuado de oligonucleótidos mutagénicos. Tal mutación se comprobó por secuenciación y la funcionalidad de esta, mediante estudios de electrofisiología.

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