L’objectiu principal de la microdiàlisi és estudiar la composició del líquid intersticial per poder monitoritzar la disponibilitat tissular de diferents metabolits, les mol·lècules que són alliberades per les cèl·lules i les conseqüències cel·lulars de la hipòxia/isquèmia tissular.
J: fluxe net; D: coeficient de difusió;δC:diferència de concentracions als dos cantons de la membrana; δX: longitud a atravessar per la membrana (gruixària de la membrana dialitzant).
Figura 5. Imatge que mostra l’intercanvi de soluts a través de la membrana de microdiàlisi. Imatge cedida per CMA Microdialysis AB, Solna, Suècia.
Una de les limitacions de la microdiàlisi és que la concentració d’una substància al dialitzat no equival necessàriament a la concentració real extracel·lular i la seva recuperació és sempre relativa. El terme recuperació o recuperació relativa es defineix com el cocient entre la concentració d’una substància determinada al dialitzat i la concentració real de la mateixa al líquid intersticial, expressat en percentatge (Ungerstedt and Rostami, 2004).En canvi, la recuperació absoluta es defineix com la quantitat de substància obtinguda al dialitzat per unitat de temps (Benveniste, 1989).
La recuperació in vitro normalment es medeix perfonent el catèter continuament a un fluxe constant i insertant el catèter en una solució aquosa, que conté la mol·lècula d’interès a una concentració coneguda. El líquid de perfusió és idèntic al líquid en el que es submergeix el catèter, excepte per la mol·lècula d’interès. La recuperació de diverses mol·lècules també es pot realitzar simultàniament. Per calcular la recuperació, es recullen diferents mostres sequencialment pel seu anàlisi posterior mitjançant mètodes de HPLC, microelectrodes o arrays de proteïnes, entre d’altres.
La recuperació relativa (RR) s’obté mijançant l’aplicació de la següent fórmula (Benveniste, 1989):
Recuperació
in vitro= C
ext/C
intCext: concentració de la substància al dializat Cint: concentració de la substància al medi
Per intentar entendre els processos que intervenen i alteren la difusió de proteïnes a través de la membrana de diàlisi, diversos autors han realitzat estudis, tant matemàtics com experimentals, amb l’objectiu d’obtenir equacions teòriques que ens permetin predir els resultats in vivo a partir dels resultats de recuperació in vitro (Amberg and Lindefors, 1989; Bungay et al., 1990; Bungay et al., 2001; Chen et al., 2002).
2.1.2.1. Factors que afecten la recuperació relativa
Existeixen diferents factors que provoquen que la recuperació a través dels catèters de microdiàlisi no reflecteixi la concentració real del líquid de l’espai extracel·lular. Entre aquests factors trobem principalment la velocitat de infusió del líquid de perfusió, la longitud de la membrana de diàlisi, les alteracions tissulars reactives que apareixen al voltant del catèter, els coeficients de difusió de les mol·lècules de interés, les propietats de la membrana de diàlisi, la composició del líquid de perfusió, el drenatge local i la pressió hidrostàtica. Aquests factors es defineixen a continuació.
Velocitat d’infusió del líquid de perfusió i longitud de la membrana
El fluxe del líquid de perfusió està inversament relacionat amb la RR. Conforme més elevada és la velocitat de perfusió més diluida està la mostra, sent la RR menor. Una hipòtesi és que amb la utilització de fluxes ràpids es produeix una major força hidrostàtica de filtració que podria afectar el transport de les substàncies (Benveniste, 1989; Kehr, 1993). Una velocitat de perfusió baixa i una membrana de diàlisi llarga proporcionen una RR elevada. Si la membrana és suficientment llarga per permetre un intercanvi de mol·lècules major i la velocitat de perfusió és baixa, la concentració al dialitzat s’aproximarà a la concentració real en el líquid intersticial, sent la recuperació de quasi el 100% (Ungerstedt and Rostami, 2004). El problema radica en que les membranes llargues són difícils d’implantar i les velocitats de perfusió massa baixes redueixen el volum de dialitzat per l’anàlisi i també afecten la resolució temporal (Johnston and Gupta, 2002).
La raó principal per la qual els resultats quantitatius entre els diferents centres siguin difícils de comparar és que s’utilitzen diferents longituds de membrana i diferents velocitats de perfusió. La creixent utilització d’equips, membranes i velocitats de perfusió estàndars i homogènies permeten obtenir resultats quantitatius més rellevants i comparables. En el cas dels catèters cerebrals i les bombes de perfusió que s’utilitzen a la clínica, la longitud estàndar de la membrana cerebral és de 10mm i la velocitat de perfusió de
0,30µl/min (Bellander et al., 2004). En aquestes condicions s’estima que la recuperació és d’aproximadament el 70% (Hutchinson, 2000).
Alteracions tissulars induïdes per la implantació del catèter
La implantació d’un catèter de microdiàlisi produeix una disrupció del teixit on es troba insertat. El catèter provoca un descens en el FSC local, en la fosforilació de la glucosa i un desacoblament entre el fluxe i el metabolisme en les primeres 24 hores després de la implantació. Trenta minuts després de la inserció del catèter la BHE es manté intacta (Benveniste, 1989). La implantació del catèter també produeix petites lesions hemorràgiques en el seu trajecte, astrogliosis i infiltració de macròfags (Whittle et al., 1998). En alguns estudis in vitro s’ha observat que la recuperació relativa depèn del temps. Inicialment la recuperació és elevada però disminueix ràpidament fins arribar a un estat “semi-estacionari”, a partir del qual va disminuint lentament. Els valors de RR no canvien significativament un cop s’ha arribat a l’estat “semi-estacionari” (Benveniste, 1989).
Coeficients de difusió
In vitro, la difusió d’un determinat metabolit només depèn del coeficient de difusió a la solució (Ds) i d’aquest coeficient a través de la membrana (Dm). La difusió al cervell i a altres teixits però, està limitada per les característiques del líquid extracel·lular i la tortuositat de l’espai intersticial. La matriu extracel·lular (MEC) té propietats algutinants degut a les glicoproteïnes i altres macromol·lècules que estan presents. Les mol·lècules poden ser ràpidament degradades al medi extracel·lular, transportades per processos actius o també poden difondre dins dels capil·lars. Tot això provoca que la recuperació in vivo
sempre sigui menor que la in vitro (Benveniste, 1989; Kehr, 1993). Un altre factor que afecta al coeficient de difusió és la temperatura, que augmenta en un 1- 2% el coeficient per cada grau centígrad (Benveniste, 1989).
Propietats de la membrana
Una membrana amb un tamany de porus petit purificarà la mostra excloent les mol·lècules grans del microdialitzat, mentre que una de tamany major recuperarà substàncies de major PM, com pèptids i proteïnes. El material del que es composen les membranes dialitzants també influeix en la recuperació, interaccionant amb diferents substàncies que són transportades per mecanismes desconeguts (Benveniste, 1989).
Composició química del líquid de perfusió i drenatge local
D’acord amb els principis de difusió, una substància ha d’estar absent del líquid de perfusió per obtenir una recuperació satisfactòria de l’analit de interès. D’altra banda, el drenatge continu d’una substància de l’espai extracel·lular pot augmentar el seu drenatge amb el temps de forma artificial, reduint-se la seva concentració a la regió propera al catèter. Així mateix, en estudis in vitro s’han observat gradients de concentració d’un metabolit de interès entre la superfície del catèter i la resta del medi, essent inferiors les concentracions del metabolit en les zones properes al catèter (Benveniste, 1989). La composició dels diferents líquids de perfusió també influeix en la recuperació. Així, si s’utilitza sèrum salí (NaCl al 0,9%) com a líquid de perfusió, sense calci (Ca2+), en comptes de Ringer amb Ca2+, això pot provocar la
deplecció del Ca2+ extracel·lular. D’aquesta manera s’afectaria l’alliberació
de neurotransmissors com el glutamat, i la concentració de substàncies depenents de la concentració de Ca2+ intra/extracelular (Hutchinson, 2000).
Pressió hidrostàtica i col·loidosmòtica
La variació en la posició del microvial de microdiàlisi produeix canvis en la pressió hidrostàtica, recollint-se menys volum si el microvial es situa en una posició elevada en relació a la punta del catèter. També s’ha descrit que la concentració de lactat és significativament inferior quan el final del tub de sortida es situa en una posició elevada (Hamrin et al., 2002). Així mateix, la presència d’un col·loid al líquid de perfusió del catèter produeix que el volum
recollit sigui major. S’han descrit variacions significatives en la concentració de glucosa amb o sense col·loid al líquid de perfusió.