The development of the principle of Substance over form

Se realizaron titulaciones espectrofluorométricas de tres compuestos (HPT, MPT y DPT) usando un espectrofluorómetro Perkin-Elmer (ver capítulo 5). No fue posible realizar la correspondiente titulación del MAF, debido a que el mismo presenta un Op extremadamente pequeño, lo que hace muy difícil la determinación experimental del valor de pKa*.

Análisis espectrqfluorométrico

La figura 10.15 muestra la variación de la intensidades de fluorescencia (If) como una función del pH en el intervalo comprendido entre 4 y 10,5. La conducta observada en esta figura se debe al equilibrio previamente mencionado entre las formas ácida y alcalina de las pterinas (ver figura 9.1). Se realizaron ajustes no lineales de estas curvas con la siguiente ecuación:

IF = la + ( Ib - la) - [ Ka* / ( K.* + [H+] )] (4)

donde Ia e Ib representan la intensidad de fluorescencia de la forma ácida y alcalina, respectivamente. Ka* es la constante de disociación.

Los resultados de estos ajustes se muestran en la figura 10.15, donde puede observarse que, en los tres casos analizados, el comportamiento experimental se ajusta perfectamente con la ecuación 4. Los valores de Ka* obtenidos mediante estos ajustes no lineales se listan en la tabla 10.6, junto con los respectivos valores de Ka obtenidos a partir de las titulaciones espectrofotométricas (ver capítulo 9). En esta tabla puede apreciarse que no hay diferencias significativas entre los dos grupos de resultados experimentales. Este hecho sugiere dos posibles explicaciones: por un lado, que las constantes de disociación del equilibrio entre las dos formas ácido-base de los estados Si* (Ka*) son iguales que las constantes de disociación correspondientes al mismo equilibrio en estado basal So (Ka); por el otro, que la desactivación de los estados Si* de las formas ácidas (alcalina) es mucho más rápida que la desprotonación (protonación).

Figura 10.15: Variación de la intensidad de fluorescencia de pterinas como función del pH. En todos los casos se excitó a valores de X correspondientes a los puntos isosbésticos. La línea continua representa la intensidad de fluorescencia calculada mediante el ajuste de los datos experimentales con la ecuación (4).

Compuesto ■K, "pKa bK.» bpK.*

HPT (8±2)xl0'9 _8,1(±0,1) (4,6±0,8)x 10'9 8,3(±0,1) MPT (4,7±0,3)xl0'9 8¿(±0,1) (6±3)xl0'9 8,3(±<U) DPT (4±2)xl0'9 8,6(±0,2) (l,5±0,8)x!09 8,8(±0,2)

Tabla 10.6: Valores de pKa para el equilibrio mostrado en la Figura 9.13. “Valores obtenidos mediante titulaciones espectrofotométricas. bValores obtenidos mediante titulaciones espectrofluorométricas.

Análisis espectrofluorométrico

10.7. Conclusiones.

Se analizaron los espectros de emisión de HPT, MPT y DPT en diferentes condiciones de pH. Estos tres compuestos presentan el comportamiento general de las pterinas descripto en el capítulo 4. Los espectros de emisión presentan una única banda, con un máximo de emisión alrededor de los 450 nm. Puede observarse un desplazamiento hacia mayores longitudes de onda de las bandas de emisión de las formas alcalinas respecto de las correspondientes a las formas ácidas. En el capítulo anterior se analizaron los respectivos espectros de absorción, mostrando que estos tres compuestos presentan, al menos, dos estados singletes excitados accesibles. El estudio de los espectros de emisión registrados excitando a diferentes longitudes de onda (A ,e x) indica la presencia de un único estado excitado emisor, independientemente del ^e x- Es decir, que el estado excitado superior (S2) que es poblado electrónicamente, decae por vías no radiativas a un único estado excitado de menor energía (Si), desde el cual ocurre la emisión fluorescente.

Por su parte, el MAF presenta un comportamiento diferente respecto de los demás compuestos estudiados. Como se expuso en el capítulo 9, este compuesto presenta una banda adicional en los espectros de absorción, originada por el anillo bencénico que forma parte del sustituyente. El análisis de los espectros de emisión muestra que cuando este compuesto se excita con Xex menores a 320 nm aparecen dos bandas de emisión: una de ellas posee un máximo de emisión alrededor de los 365 nm y otro con el máximo cercano a los 450 nm. Estos resultados sugieren la existencia de dos estados electrónicamente excitados emisores. El estudio de la dependencia de los espectros de emisión con el pH muestra que la posición de la banda de mayor energía permanece invariante mientras que la posición de la banda de menor energía presenta el corrimiento batocrómico característico de las pterinas. Sobre la base de los resultados expuestos en este capítulo y teniendo en cuenta el comportamiento general de las pterinas, puede suponerse que la banda de emisión con el máximo alrededor de 450 nm corresponde al anillo pterínico y que la otra banda de emisión, ubicada alrededor de 365 nm, corresponde a la emisión del PABG.

Se determinaron los rendimientos cuánticos de emisión fluorescente (Op) de HPT, MPT, DPT y MAF, excitando a 350 nm. Se analizaron soluciones ácidas y alcalinas, en tres atmósferas diferentes: saturadas con Ar, equilibradas con aire y saturadas con O2. Con

fines comparativos, en la tabla 10.7 se muestran los valores de Of medidos en atmósfera de aire, de los cuatro compuestos estudiados, junto con los valores publicados en la literatura para otros derivados pterínicos11'31. Puede apreciarse que la emisión fluorescente de las pterinas es fuertemente dependiente del pH y de la naturaleza química del sustituyeme presente en la posición 6 del anillo pterínico. Para HPT, MPT y DPT se obtuvieron valores de Of relativamente altos. Los Op de las formas ácidas de estos tres compuestos son ligeramente mayores que los correspondientes a las formas alcalinas.

Por su parte, los valores significativamente inferiores de Op obtenidos para el MAF sólo son comparables con los Op del AF, otro derivado pterínico estructuralmente muy relacionado^131. Este hecho sugiere que los sustituyentes relativamente grandes incrementan la eficiencia de los procesos de desactivación no radiativa, lo que disminuye la emisión fluorescente. Estos sustituyentes podrían actuar como quencher interno, incrementando el número de estados vibrorrotacionales de la molécula, favoreciendo así la desactivación no radiativa. Otra posibilidad consiste en una desactivación, también no radiativa, pero producida por choques intermoleculares. Con el objeto de entender más acerca de estos mecanismos de desactivación, se realizaron experimentos de quenching, donde se estudió el efecto de la concentración del PABG y del PABA, sobre la fluorescencia de MPT. Estos resultados permiten descartar el mecanismo de desactivación por choques intermoleculares, sugiriendo que, para que exista este efecto desactivante, el sustituyente debe estar unido de forma covalente al anillo pterínico.

Com puesto (Df (pH=5,5) 4>k (pH=I0,5)

HPT 0,53 0,46