Different time evolution of nucleation in the two models

Los ápices de las raicillas así coloreados y tratados se colocaron entre láminas “porta” y “cubre” objetos para su aplastamiento o "squash" (Fig.10 C-H.); obteniéndose de esta manera preparados citológicos para observación al microscopio compuesto tanto con el objetivo de 40 aumentos como el objetivo de inmersión.

Posteriormente, se procedió a contar un total de 2000 células meristemáticas por cada uno de los diferentes tratamientos ensayados, y de igual manera para los valores del índice mitótico y de las fases del ciclo celular (Fig.11.).

Los bioensayos se realizaron en tres repeticiones y los datos obtenidos se expresaron en porcentaje y además fueron analizados estadísticamente utilizando el programa Statgraphics Centurión versión de prueba 5.1. para Windows.

BIBLIOTECA

FIGURA 11: Observación de preparados citológicos al microscopio compuesto contando aproximadamente un total de 2000 células meristemáticas por cada uno de los diferentes tratamientos ensayados.

FIGURA 12: El tratamiento 12correspondiente a la concentración de 100 µg/mL y a un tiempo de exposición de 24 horas de Annona muricata “guanábana”, ocasiona una disminución del índice mitótico y un aumento en el índice profásico

BIBLIOTECA

III. RESULTADOS

En el presente trabajo, se determinó el efecto del extracto acuoso de Annona muricata “guanábana” a concentraciones de 0.0 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, y 100 µg/mL durante 6, 12 y 24 horas respectivamente sobre el ciclo celular en meristemos radiculares de Allium cepa“cebolla”, obteniéndose los siguientes resultados:

En la tabla 1, se observan los Promedios, en porcentajes, del Índice Mitótico e Índice de Fases; en el cual se aprecia una considerable disminución del IM a la concentración de 100 µg/mL durante un tiempo de exposición de 24 horas, correspondiente al tratamiento 12 (T12); de igual manera la presente tabla muestra un aumento notable del Índice Profásico así como una reducción abrupta de los demás índice de fases (Metafásico, Anafásico y Telofásico), correspondientes al mismo tratamiento (T12).

BIBLIOTECA

Tabla 1: Promedios, en porcentajes, del Índice Mitótico e Índice de Fases (Índice Profásico, Metafásico, Anafásico y Telofásico) en células meristemáticas de raíces de Allium cepa, tratados con extracto etanólico de Annona muricata a distintas concentraciones y tiempos.

TRATAMIENTOS INDICE MITÓTICO (%)

INDICE DE FASES (%)

PROFASE METAFASE ANAFASE TELOFASE

T1 23.70 50.46 17.10 10.41 30.03 T2 18.78 63.84 17.75 8.94 9.15 T3 12.07 66.00 17.06 6.63 8.31 T4 14.77 73.73 14.20 5.65 6.41 T5 20.02 33.39 18.27 12.83 35.84 T6 10.85 58.37 17.37 13.50 11.09 T7 8.33 64.40 17.21 10.20 8.20 T8 9.07 67.97 17.38 7.80 6.52 T9 20.35 42.02 14.16 11.44 30.72 T10 13.38 78.58 11.70 5.98 3.74 T11 9.18 74.41 16.70 5.84 2.72 T12 7.52 87.93 5.98 4.43 1.33

BIBLIOTECA

DE POSGRADO

En la Tabla 2; se puede apreciar claramente un Análisis de Varianza (ANOVA) para el Índice Mitótico; el mismo que nos muestra la presencia de diferencias significativas entre los tratamientos; cabe resaltar que dichos resultados fueron corroborados por la Prueba de Tukey en la Tabla 3, indicando como mejor tratamiento al T12, con una disminución del índice mitótico de 20.35% (T9 control) a 7.52%.(T12).

Tabla 2. Análisis de Varianza (ANOVA) para el Índice Mitótico, en células meristemáticas de raíces de Allium cepa, tratados con extracto etanólico de Annona muricata a distintas concentraciones y tiempos.

Fuente Suma de

Cuadrados Gl

Cuadrado

Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 989.412 11 89.9466 112.96 0.0000 Intra grupos 19.11 24 0.79625 Total (Corr.) 1008.52 35

Tabla 3. Prueba de Tukey, para el Índice mitótico en células meristemáticas de raíces de Allium cepa.

TRATAMIENTOS Casos Media Grupos

Homogéneos 12 3 7.51667 X 7 3 8.33333 XX 8 3 9.06667 X 11 3 9.18333 X 6 3 10.85 X 3 3 12.0667 XX 10 3 13.3833 XX 4 3 14.7667 X 2 3 18.7833 X 5 3 20.0167 XX 9 3 20.35 X 1 3 23.7 X (P≤0,05).

X indica una diferencia significativa.

BIBLIOTECA

En las tablas siguientes 4,6,8,10; se detalla minuciosamente la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos a través de un Análisis de Varianza (ANOVA) tanto para el Índice Profásico (Tabla 4), Índice Metafásico (Tabla 6), Índice Anafásico (Tabla 8) e Índice Telofásico (Tabla 10).

Finalmente las Tablas 5,7,9 y 11; nos muestra el tratamiento ideal para cada una de los Índices de fases mencionados anteriormente a través de la prueba Tukey, indicando como mejor tratamiento al T12, ya que en este se puede apreciar un cambio abrupto en cuanto a los valores en porcentajes en cada uno de los índices, con un aumento de 42.02% ( T9 control) a 87.93% (T12) en el Índice Profásico (Tabla 5), Así como con una disminución notable de 14.16% ( T9 control) a 5.98% (T12) en el Índice Metafásico; de 11.44% ( T9 control) a 4.43% (T12) en el Índice Anafásico así como de 30.72% ( T9 control) a 1.33% (T12) en el Índice Telofásico.

Tabla 4. Análisis de Varianza (ANOVA) para el Índice Profásico, en células meristemáticas de raíces de Allium cepa, tratados con extracto etanólico de Annona muricataa distintas concentraciones y tiempos.

Fuente Suma de

Cuadrados Gl

Cuadrado

Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 7917.61 11 719.782 543.8 0.0000 Intra grupos 31.7666 24 1.32361 Total (Corr.) 7949.37 35

BIBLIOTECA

DE POSGRADO

Tabla 5. Prueba de Tukey, para el Índice profásico en células meristemáticas de raíces de

Allium cepa.

TRATAMIENTOS Casos Media Grupos

Homogéneos 5 3 33.3933 X 9 3 42.02 X 1 3 50.4567 X 6 3 58.3667 X 2 3 63.84 X 7 3 64.4 XX 3 3 66.0033 X 8 3 67.9667 X 4 3 73.7333 X 11 3 74.4067 X 10 3 78.5833 X 12 3 87.9267 X (P≤0,05).

X indica una diferencia significativa.

Tabla 6. Análisis de Varianza (ANOVA) para el Índice Metafásico, en células meristemáticas de raíces de Allium cepa, tratados con extracto etanólico de Annona muricata a distintas concentraciones y tiempos.

Fuente Suma de

Cuadrados Gl

Cuadrado

Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 412.793 11 37.5267 39.75 0.0000 Intra grupos 22.6551 24 0.943964 Total (Corr.) 435.448 35

BIBLIOTECA

DE POSGRADO

Tabla 7. Prueba de Tukey, para el Índice Metafásico en células meristemáticas de raíces de

Allium cepa.

TRATAMIENTOS Casos Media Grupos

Homogéneos 12 3 5.97667 X 10 3 11.7033 X 9 3 14.16 X 4 3 14.2033 X 11 3 16.7 X 3 3 17.0567 X 1 3 17.1033 X 7 3 17.2067 X 6 3 17.37 X 8 3 17.38 X 2 3 17.7467 X 5 3 18.2733 X (P≤0,05).

X indica una diferencia significativa.

Tabla 8. Análisis de Varianza (ANOVA) para el Índice Anafásico, en células meristemáticas de raíces de Allium cepa, tratados con extracto etanólico de Annona muricata a distintas concentraciones y tiempos.

Fuente Suma de

Cuadrados Gl

Cuadrado

Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 302.982 11 27.5438 28.54 0.0000 Intra grupos 23.1591 24 0.964964 Total (Corr.) 326.141 35

BIBLIOTECA

DE POSGRADO

Tabla 9. Prueba de Tukey, para el Índice Anafásico en células meristemáticas de raíces de

Allium cepa.

TRATAMIENTOS Casos Media Grupos

Homogéneos 12 3 4.43333 X 4 3 5.65 XX 11 3 5.83667 XX 10 3 5.97667 XX 3 3 6.62667 XX 8 3 7.79667 XX 2 3 8.93667 XX 7 3 10.1967 XX 1 3 10.41 XX 9 3 11.4367 XX 5 3 12.83 XX 6 3 13.5 X (P≤0,05).

X indica una diferencia significativa.

Tabla 10. Análisis de Varianza (ANOVA) para el Índice Telofásico, en células meristemáticas de raíces de Allium cepa, tratados con extracto etanólico de Annona muricata a distintas concentraciones y tiempos.

Fuente Suma de

Cuadrados Gl

Cuadrado

Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 4804.72 11 436.793 128.35 0 Intra grupos 81.6781 24 3.40326 Total (Corr.) 4886.4 35

BIBLIOTECA

DE POSGRADO

Tabla 11. Prueba de Tukey, para el Índice Telofásico en células meristemáticas de raíces de

Allium cepa.

TRATAMIENTOS Casos Media Grupos

Homogéneos 12 3 1.33 X 11 3 2.72333 X 10 3 3.73667 XX 4 3 6.41 XX 8 3 6.52333 XX 7 3 8.2 XX 3 3 8.31333 XX 2 3 9.14667 XX 6 3 11.0933 X 1 3 30.03 X 9 3 30.7167 X 5 3 35.8367 X (P≤0,05).

X indica una diferencia significativa.

BIBLIOTECA

IV. DISCUSIÓN

Luego de analizar los resultados obtenidos a partir de los diferentes tratamientos del extracto etanólico de Annona muricata “guanábana”, se observó una variación en los valores del índice mitótico (Im), el mismo que paso, desde 23.70 %, Control (T1), hasta 12.07 % (T3) al cabo de 6 horas; desde 20.02 %, Control (T5), hasta 8.33 (T7) al cabo de 12 horas y desde 20.35 %, Control (T9), hasta 7.42 (T12) al cabo de 24 horas; indicando en todo momento una disminución notable del Im, y a su vez vislumbrando la existencia de diferencias significativas; según el Análisis de Varianza (ANOVA) (Tabla 2), lo que nos estaría indicando que a diferentes concentraciones de extracto etanólico se generan distintas respuestas celulares; siendo el mejor tratamiento según la prueba de TUKEY (Tabla 3) el T12, esto debido probablemente a que a esta concentración el extracto acuoso contiene la cantidad suficiente de taninos, ácidos, ésteres triterpénicos, alcaloides, heterósidos de sitosterol y estigmasterol que estarían generando un efecto oxidativo, el mismo que afectaría la formación del complejo CdK1-ciclina B; que a su vez forma el Factor Promotor de la Mitosis (FPM); lo que traería como consecuencia el impedimento del normal paso celular de la fase G2, hacia la mitosis (Shimotohno et al., 2003); disminuyendo de este modo el número de células en división; similares resultados se obtuvieron en ensayos con extractos etanólicos de Glycine max “soja” (Díaz, 2011).

En relación al IP (Tabla 1 ), se observó que este se incrementa notablemente, tanto a 6, 12 y 24 horas, por sobre sus respectivos controles, a su vez también se puede apreciar la existencia de diferencias significativas entre los tratamiento (Tabla 4); siendo el mejor tratamiento mediante la prueba de TUKEY (Tabla 5) el T12, correspondiente a

BIBLIOTECA

87.93 % en (T3), con respecto a su control. Lo que ratificaría en principio el efecto oxidativo de los compuestos presentes en dicho extracto que estarían afectando la formación del complejo Ciclina B- cdk1, responsable de activar a las proteínas del mantenimiento estructural cromosómico conocidas como condensinas, encargadas de llevar a cabo la polimerización de microtúbulos para la formación del huso mitótico, que de no formarse sería casi imposible la transición normal de las células desde la profase hacía la metafase (Jiménez, Merchant, 2003; Lodish et al., 2002; Paniagua et al., 2002 ). Lo que concuerda por lo descrito por diversos investigadores; quienes afirman que el tránsito de profase a metafase requiere de factores de transcripción y de traducción, esenciales para la realización de este proceso (Basto et al., 2000).

La disminución del Índice Metafásico (IMet) (Tabla 1), se pudo observar en todos los tratamientos; apreciándose diferencias significativas entre los tratamientos (Tabla 6); siendo el mejor tratamiento el T12 (Tabla 7), el mismo que alcanzo valores de hasta 5.98 %, esto se debería a la inhibición del FPM, disminuyendo el ensamblaje del huso mitótico y dejando de inducir la polimerización de microtúbulos que se elaboran perpendicularmente al eje mayor del cromosoma y que se anclan por una de sus extremidades en el cinetocoro; logrando alcanzar un menor número de células durante la metafase con respecto a los controles (Dulot et al., 1982); tal como lo experimentaron Basto et al (2000), quienes afirmaron durante sus ensayos que en la metafase los cromosomas están sujetos por el centrómero a los microtúbulos del huso acromático, de tal forma que si este no se organiza los cromosomas pierden orientación y no migraran a los polos; a su vez estos mecanismos vienen siendo monitoreados usando una serie de inhibidores que mantienen los cromosomas en una fase determinada de la mitosis.

BIBLIOTECA

Los Índices Anafásico (IA) y Telofásico (IT) (Tabla 1) de los tratamientos expuestos al extracto etanólico de “guanábana” también disminuyeron con respecto a sus controles de 6, 12 y 24 horas; así mismo tanto para el índice Anafásico (IA) e Índice Telofásico (IT) se observaron diferencias significativas (Tablas 8 y 10 ) respectivamente; siendo el mejor tratamiento para ambas el T12 (Tablas 9 y 11), con una disminución tal que alcanzó los 4.43 % en su Índice Anafásico y tan sólo un 1.33 % en su Índice Telofásico; dicha disminución, estaría ocurriendo debido a que el aumento del número de células en profase genera una disminución en metafase y por ende una disminución en anafase (León, 1964)..

Además la disminución del IA, se originaría debido a que la acción oxidativa de los compuestos presentes en el líquido de ensayo estarían inhibiendo la actividad catalítica de las cohesinas, las cuales a su vez se encargan de llevar a cabo el proceso de segregación de cromátidas hermanas; no permitiendo entonces, que las células transiten normalmente hacia anafase y consecuentemente hacia telofase; cabe mencionar que el bloqueo del inicio de algunas fases del ciclo celular, puede constituir una alternativa de terapia neoplásica mediante productos naturales, siendo esta investigación un punto base para investigaciones futuras en esta especie (León, 1964).

BIBLIOTECA

V. CONCLUSIONES

El extracto etanólico de Annona muricata “guanábana”, a la concentración de 100 µg/mL y 24 horas de exposición ocasiona una disminución del Índice Mitótico; alcanzando valores de 7.52 %; un aumento del Índice Profásico de 87.93 % en meristemos radiculares de Allium cepa var. roja arequipeña.

Igualmente el extracto etanólico de Annona muricata “guanábana”, a 100 µg/mL y a 24 horas de exposición produce una disminución del Índice Metafásico en 5.98%, del Anafásico en 4.43% y Telofásico del 1.33%, en meristemos radiculares de Allium. cepa var. roja arequipeña con respecto al resto de tratamientos.

BIBLIOTECA

VI. PROPUESTA

El descubrimiento tanto de fármacos de origen biológico (vegetales y animales), como los resultantes de la investigación química (descubrimiento, simulación y síntesis de muchos compuestos químicos) determinó el desarrollo y progreso de la medicina occidental, actualmente extendida en todo el mundo, con resultados muchas veces sorprendentes y rápidos en la cura y/o alivio de las diferentes enfermedades que atacan al hombre. Sin embargo este desarrollo de la medicina, hoy en día, es también motivo de múltiples preocupaciones debido a que muchas veces estos fármacos a la par de curar también ocasionan daños colaterales al organismo; daños que vienen siendo evaluados e investigados actualmente.

Frente a esta realidad el desarrollo y progreso de la medicina tradicional y especialmente la basada en las plantas, fue un tanto relegada al uso exclusivo de las poblaciones rurales y suburbanas donde la medicina occidental no llegó o llegó esporádicamente. Por tanto para este tipo de comunidades la fitoterapia se constituyó en la única alternativa de cura y/o alivio de sus enfermedades.

Igualmente la práctica de la medicina tradicional y de la fitoterapia en particular, actualmente está siendo usada por más del 80% de la población mundial, sin que muchos de sus conocimientos, métodos y prácticas hayan sido validados aún por la investigación científica.

Actualmente asistimos afortunadamente a una revalorización de la medicina tradicional y el uso de las plantas medicinales específicamente en el mundo, debido a que las investigaciones cada vez más frecuentes están determinando que el uso de las plantas medicinales sigue constituyéndose en verdaderas alternativas para la cura de las más diversas enfermedades que se conocen.

En tal sentido están cobrando gran interés las plantas medicinales con propiedades para detener enfermedades de las consideradas más graves para el hombre, como es el caso de los más variados tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares, diabetes y de las que aquejan de manera muy particular a diferentes órganos de nuestro

BIBLIOTECA

organismo (es muy conocido el uso de plantas medicinales indicadas para el corazón, hígado, riñones, cerebro, pulmones, etc.)

Ahora bien las plantas medicinales con propiedades para detener o disminuir las diferentes fases del ciclo celular y por tanto el crecimiento acelerado de células cancerígenas están alcanzando gran interés por parte de los investigadores. Tal es el caso de las especies del género Annona representadas en el Perú por 19 especies de las cuales 4 son endémicas, y a las cuales se les atribuye efectos para disminuir el Índice Mitótico en sus diferentes fases y por tanto palear los efectos oncogénicos que sufren muchas personas. En este sentido es muy conocido el uso de la Annona muricata “guanábana” que ha sido investigada y que esta investigación ha determinado que disminuye el Índice Mitótico alcanzando un valor de 7,52%, un aumento del Índice Profásico de 87,93% en meristemos radicales de cebolla y a su vez se ha demostrado que el extracto etanolito a concentraciones de 100 µg./ml. Y a 24 horas de exposición disminuyen el Índice Metafásico en 5,98% del Anafásico en 4,43% y del Telofásico en 1,33% en meristemos radicales de cebolla.

Estos resultados son muy alentadores puesto que determinan que el uso de esta especie puede paliar los efectos de algunos tipos de cáncer.

Por ello nos permitimos proponer que las instituciones comprometidas con la salud deben apoyar y financiar investigaciones cada vez más orientadas a las plantas medicinales, puesto que se está demostrando la efectividad que tienen muchas de ellas y en ocasiones con mejores resultados que los alcanzados por la medicina occidental.

Muy bien se haría en iniciar una línea de investigación de las 19 especies del género Annona y particularmente de las 4 especies de Annona que son endémicas para el Perú: Annona asplundiana, A. dolychophylla, A. iquitensis y A. deminuta, en el sentido de que cualquier descubrimiento de propiedades medicamentosas de sus metabolitos secundarios se constituirían en un verdadero aporte del Perú a la medicina mundial con la consiguiente ganancia de divisas que implicaría su patente.

BIBLIOTECA

En forma inmediata los resultados de esta investigación podrían servir para recomendar que el uso de esta especie pueda formar parte del tratamiento de enfermedades oncogénicas como complemento a la medicina de uso actual.

BIBLIOTECA