Discussion and Limitations

Los precursores procesados desde el loop hacia la base tienen dos cortes en las bibliotecas de SPARE. Estos se encuentran en los extremos del miARN/miARN* (Figura R1.6A). Se hallaron cinco nuevos precursores con este tipo de cortes. En la Figura R1.6B se muestran los resultados obtenidos para los precursores demiR162a y miR408. Los precursores de miR157a, miR157b y miR157c, que comparten este mecanismo de procesamiento, se desarrollaran en el capítulo de RESULTADOS II (ANEXO A3).

Se ha visto que muchos precursores procesados desde el loop tienen una región superior estructurada de ~42nt, que incluye un segmento de ARNdh y un loop terminal pequeño, por encima del dúplex del miARN (Bologna et al., 2013b). Si bien tanto el precursor de miR162a como el precursor de miR408 presentan estas características (Figura R1.6B, recuadro verde), los determinantes estructurales de este tipo de mecanismo de procesamiento no han sido evaluados experimentalmente por el momento.

El precursor de miR408 había sido descripto previamente como un precursor procesado desde la base al loop (Bologna et al., 2013b) sin embargo, en estas bibliotecas resulta claro que hay dos posiciones de corte para el mismo. Una re-evaluación de los datos originales, mostró que el precursor de miR408 presentaba pocas lecturas, en contraste con las 20.190 lecturas para las bibliotecas de Col-0. Las modificaciones técnicas permitieron obtener un mayor número de lecturas para este precursor, lo cual permitió corregir la dirección de procesamiento adjudicada.

Tanto MIR162a como MIR408 están conservados en angiospermas en general, y cumplen diversas funciones (Cuperus et al., 2011). miR408 participa de la homeostasis del Cu al regular los niveles de plastocianina (Maunoury and Vaucheret, 2011). Por otro lado miR162 es un miARN de vital importancia, ya que es el regulador negativo de DCL1, la enzima responsable de la biogénesis de miARNs (Xie et al., 2003). Es el único miembro de la familia, cuya dirección de procesamiento se conoce y pudo establecerse tanto en plantas silvestres como en fiery1. También se detectaron los cuatro cortes que requiere el precursor de miR159a para liberar el miARN maduro. Este mecanismo de procesamiento secuencial es compartido por otros miembros de la familia (Bologna et al., 2009). Este miARN regula a factores de transcripción MYB (Palatnik et al., 2007)(ANEXO A5).

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Figura R1.6. Identificación de sitios de corte en precursores de miARNs procesados en dirección loop a base. A) Representación esquemática de un precursor procesado desde el loop a la base con dos cortes de DCL1. Se muestra la posición del primer y segundo corte, ambos detectados por SPARE. La región superior, compuesta por un segmento de ARNdh, en color verde y el loop terminal, en color amarillo, serían reconocidos por la maquinaria de procesamiento.

B) Estructuras secundarias predichas para los precursores de miR162a y miR408. El miARN se muestra en color rojo y el miARN* en celeste. Las flechas indican las posiciones de los diferentes cortes: de biogénesis verde oscuro y rojo oscuro, impreciso, verde claro y rosa, y espurio, en color gris, según sean en Col-0 o fiery1 respectivamente. Cada flecha está acompañada de un número que representa la abundancia de dicho corte. En todos los casos los 3 cortes mayoritarios están indicados en negrita.

6.5. Detección de cortes abortivos en precursores de miARN in vivo.

En las bibliotecas de SPARE, se obtuvieron cortes que flanqueaban al miARN/miARN*. Estos cortes son los responsables de la biogénesis del miARN maduro y dada la estrategia diseñada también permiten dilucidar la dirección de procesamiento. Sin embargo, para ciertos precursores de miARNs, además se recuperaron cortes que caían dentro del dúplex miARN/miARN* (Figura R1.4B precursor de miR173, Figura R1.5B precursor de miR169i y miR402 y FiguraR1.6B precursor demiR162a y miR408). Este tipo de cortes espurios son abortivos ya que anulan la posibilidad de generar el miARN a partir del precursor.

A continuación, nos concentramos en aquellos precursores que presentaban cortes abortivos con una abundancia del al menos el 5% respecto a los cortes productivos responsables de la biogénesis.

87 Encontramos cortes en ocho precursores que satisfacían este criterio. Los precursores de miR164b, miR395c y miR158a, son procesados desde la base al loop con dos cortes, a partir de reconocimiento de un tallo inferior de ARNdh ~15pb (Figura R1.7A, línea verde). En estos precursores encontramos cortes improductivos dentro de la región del miARN/miARN*. A continuación procedimos a evaluar si estos cortes podían deberse a la actividad de la maquinaria de procesamiento de miARNs mediante el reconocimiento de determinantes estructurales secundarios presentes en el precursor.

En el caso del precursor de miR164b, vimos que los cortes improductivos se encontraban a una distancia de ~15-18pb de un loop interno contenido dentro del tallo inferior de ARNdh (Figura R1.7A, recuadro amarillo). Un patrón similar puede observarse en el precursor de miR158a. A partir de aquí, se puede proponer que la maquinaria de procesamiento estaría reconociendo equivocadamente un determinante estructural secundario, similar al que produce el miARN endógeno.

El precursor de miR400 es procesado desde el loop, probablemente debido al reconocimiento de la región terminal de ~38nt (Figura R1.7B, línea gris). En este caso los cortes abortivos coinciden con el reconocimiento de un segmento de ARNdh presente en el tallo inferior, ~15pb por debajo del dúplex del miARN y por encima de un loop interno (Figura R1.7B, recuadro amarillo). A diferencia de lo mencionado en el párrafo anterior, aquí la dirección de procesamiento y la dirección de los cortes abortivos serían opuestas.

Los precursores de miR393a, miR393b, miR396 y miR864 se procesan desde la base, a través del reconocimiento de un tallo inferior de ARNdh de ~15pb, indicado con una línea verde (Figura R1.7C). Sin embargo ninguno presenta un loop inferior que pudiera ser responsable de los cortes abortivos. Por el contrario, todos presentan un loop terminal ramificado de gran tamaño, ubicado a ~15-19pb de los cortes improductivos. Recientemente, se ha mostrado que ciertos loops terminales pueden ser reconocidos por la maquinaria de procesamiento (Zhu et al., 2013), lo que daría una explicación al mecanismo de origen de estos cortes.

Trabajos anteriores han mostrado que otros precursores de miARNs son susceptibles a cortes abortivos, entre ellos se destacan el precursor de miR472, el cual no fue detectado en nuestras bibliotecas y el precursor de miR825. Para precursor se detectó un corte abortivo localizado a seis nucleótidos del extremo inferior del miARN, que es idéntico al que se encuentra publicado, lo cual refleja la reproducibilidad los datos obtenidos a partir de bibliotecas de SPARE (Bologna et al., 2013b)(ANEXO 41). Es interesante destacar que los cortes improductivos se encontraron tanto en precursores conservados como jóvenes, que se procesan en dirección de base a loop y de loop a la base. A su vez no parece haber una distinción entre en miARNs que responden a stress o regulen factores de transcripción asociados al desarrollo. Es tentador pensar que los cortes improductivos representen un nivel adicional de regulación de la expresión génica, y cuya función biológica sea controlar las cantidades finales de miARN maduro.

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A) Estructuras secundarias predichas para los precursores de miR164b, miR395c, miR158a y miR400. El miARN se muestra en color rojo y el miARN* en celeste. Estos precursores son procesados desde la base al loop, a partir de reconocimiento de un tallo inferior de ARNdh de ~15pb, indicado con una línea verde. Las flechas indican las posiciones de los diferentes cortes: de biogénesis verde oscuro y rojo oscuro, impreciso, verde claro y rosa, y espurio, en color gris, según sean en Col-0 o fiery1 respectivamente. Los cortes abortivos coinciden con el reconocimiento de un loop interno (recuadro amarillo). En todos los casos los 3 cortes mayoritarios están indicados en negrita.

B) Estructura secundaria predicha para el precursor de miR400. El miARN se muestra en color rojo y el miARN* en celeste. El mismo es procesado desde el loop a la base, probablemente a partir de reconocimiento de la región terminal ~38nt, línea gris. Las flechas indican las posiciones de los diferentes cortes: de biogénesis verde oscuro y rojo oscuro, impreciso, verde claro y rosa, y espurio, en color gris, según sean en Col-0 o fiery1 respectivamente. Los cortes abortivos se coinciden con el reconocimiento de una burbuja interna (recuadro amarillo). En todos los casos los 3 cortes mayoritarios están indicados en negrita.

C) Estructuras secundarias predichas para los precursores de miR393a, miR3393b, miR396b y miR864. El miARN se muestra en color rojo y el miARN* en celeste. Todos estos precursores son procesados desde la base al loop, a partir de reconocimiento de un tallo inferior de ARNdh de ~15pb, línea verde. Las flechas indican las posiciones de los diferentes cortes: de biogénesis verde oscuro y rojo oscuro, impreciso, verde claro y rosa, y espurio, en color gris, según sean en Col-0 o fiery1 respectivamente. Los cortes abortivos coinciden con el reconocimiento de una burbuja terminal ramificada (recuadro amarillo). En todos los casos los 3 cortes mayoritarios están indicados en negrita.