La inserción de una lente de contacto altera la película lagrimal, inmovilizando los lípidos y prolongando su exposición a la oxidación ambiental según indica una de las principales conclusiones de la revisión realizada por Panaser y Tigher acerca de las funciones de los lípidos y su destino en las lentes de contacto. Esto hace que los lípidos procedentes de la lágrima que son, en condiciones normales, beneficiosos para el ojo, tras su degradación se conviertan en uno de los motivos de intolerancia a las lentes de contacto por parte de los usuarios [Panaser y Tighe, 2012].
Reequilibrado las lentes de contacto en solución salina normalizada isotónica durante 24h Caracterización de las lentes para distinguir
cambios reversibles de los irreversibles
SI
¿Se cumplen las especificaciones y tolerancias de la Norma ISO
18369-2? Físicamente compatible; cambios reversibles Físicamente no compatible NO Paso 2
Es por lo tanto importante conocer la cantidad de lípidos que se acumulan en la lente de contacto y si las soluciones existentes son capaces de retirarlos y en qué medida lo hacen. Sin embargo, no existen estudios normalizados para la cuantificación de los lípidos acumulados en las LCH.
Los estudios publicados muestran distintos métodos “in vitro” y “ex vivo” para cuantificar los lípidos que se acumulan en las lentes de contacto, como son la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) [Heynen, 2011], cromatografía de gases y espectrometría de masas [Saville et al, 2010] y la reacción enzimática del colesterol esterasa [Pucker et al, 2010].
Según la revisión realizada por Pucker en 2012 sobre el análisis de los lípidos procedentes de las glándulas de Meibomio y la lágrima, existen métodos específicos para analizar los lípidos acumulados en las lentes de contacto. Sin embargo, las conclusiones de su revisión en relación a los lípidos acumulados en las lentes de contacto, determinan que aún es necesaria una evolución de las técnicas de extracción y análisis [Pucker et al, 2012].
En el caso que nos ocupa se emplea una técnica de extracción basada en el método de Folch [Folch et al., 1957], por ser el más ampliamente empleado. Como técnica de análisis se realizará una HPLC debido que la sensibilidad del método permite cuantificar cantidades muy pequeñas de lípidos, y a que la temperatura de trabajo que no altera las muestras.
Para la realización de este estudio se seleccionaron cuatro de las cinco soluciones descritas, con la composición y número de lote que se indica en la tabla 9, y 15 lentes de contacto con filtro de absorbancia selectiva, con distintas potencias, divididas en cinco grupos de tres lentes, asignándose cada grupo a cada una de las soluciones de limpieza y mantenimiento, y dejando uno de los grupos como grupo control.
Tabla 9. Soluciones empleadas en el estudio de limpieza de lípidos.
Producto Lote Composición principal
Avizor Única Sensitive® (Solución Única)
D488A Solución acuosa, isotónica, y tamponada con hialuronato sódico, poloxamer, EDTA, polihexanida 0,0001%.
All Clean Soft® (Solución Única)
D458B Solución acuosa, isotónica, y
tamponada con poloxamer, EDTA, PVP, polihexanida 0,0002% y agente
removedor de proteínas. Ever Clean Pure®
(Peróxido de Hidrógeno al 3%)
E26929 Solución de peróxido al 3%,
comprimido neutralizante y agente de limpieza.
Cleaning Drops® (Solución humectante)
D387A Solución acuosa, isotónica, y tamponada con poloxamer, EDTA, Povidona y Polihexanida 0,0001%.
En este caso no se empleó la solución Moisture Drops® ya que entre sus funciones no se encuentra la de limpieza de las lentes de contacto.
En la tabla 10 se describe el instrumental, material de laboratorio y reactivos empleados en el estudio.
Tabla 10. Instrumental, material de laboratorio y reactivos empleados en el estudio de limpieza de lípidos.
Instrumental y material de laboratorio Reactivos
Equipo HPLC Hexano
Columna de fase reversa Luna 5 µm C18 Éter
Congelador. Colesterol libre (C27H46O) Mezclador vórtex Colesterol oleato (C45H78O2) Incubador o estufa de incubación Cloruro Sódico (ClNa)
Cabina estéril Fosfato monosódico (NaH2PO4x2H2O) Sonicador de ultrasonidos Fosfato disódico (Na2HPO4x12H2O)
Centrífuga Hidróxido sódico (NaOH)
Matraz aforado de 500 ml Cloroformo
Frascos ISO de 500 ml y 1 litro Metanol
Portalentes cilíndricos con válvula Butil HidroxiTolueno (BHT)
Placas ELISA Nitrógeno (N2)
Hidróxido Potásico (KOH)
Etanol
Equipo HPLC de Beckman Instruments, Palo Alto, CA; modelo 168. Columna de Phenomenex, Torrance, CA.
El método empleado para medir la eficacia de limpieza “in vitro” frente a lípidos que se emplea en este estudio consta de 5 etapas:
1. Preparación de solución de lípidos similar a la lágrima humana (TLS)
El primer paso consiste en preparar una solución que contenga lípidos presentes en la lágrima humana, con el fin de “ensuciar” las lentes de contacto a tratar de modo similar a cómo en ensuciarían en el ojo.
Para ello, teniendo en cuenta que, según Lam [Lam, 2011], el 67% de los lípidos presentes en la lágrima procedentes de las glándulas de Meibomio son Ésteres de Colesterol, se prepara una solución que contenga este tipo de lípidos.
La cantidad de lípido a utilizar, siguiendo las indicaciones de Lorentz [Lorentz, Holly, 2006] es tres veces superior a la que contiene la lágrima humana. Por tanto las soluciones contendrán:
• 0,17 mg/ml de Colesterol Libre • 0,23 mg/ml de Colesterol Oleato
Para preparar la citada solución los pasos a seguir son los siguientes:
I. Preparación de dos soluciones primarias de lípidos. Antes de preparar la solución definitiva, y con el fin de evitar la precipitación de algunos componentes, los lípidos deben disolverse en gran concentración en una solución hexano: éter. Las disoluciones que se realizan son:
- Solución 1: Colesterol: 8,5 mg/mL de 50:50 hexano:éter
- Solución 2: Colesterol oleato: 11,5 mg/mL de 50:50 hexano:éter
II. Preparación de una solución salina (PBS) de acuerdo a la norma UNE-EN ISO 10344:1999. Para ello se utilizaron los siguientes componentes:
- 8,300g de Cloruro sódico (ClNa)
- 0,528 g de Fosfato monosódico dihidratado (NaH2PO4x2H2O) - 5,993 g de Fosfato disódico dodecahidratado (Na2HPO4x12H2O) - 1000 ml (c.s.p.) de agua (H2O)
III. El último paso es la preparación de la solución TSL, para lo que:
- Las soluciones primarias de lípidos se estabilizan a temperatura
ambiente.
- La solución PBS se calienta a 37°C en un tubo de cultivo estéril. - En campana o cabina estéril se añaden a 10 ml de la solución PBS,
200 µl de cada una de las soluciones primarias de lípidos.
- Con el fin de evaporar el éter y el hexano, los tubos se mantuvieron a
37°C con la tapa abierta, almacenando la solución resultante a -4°C durante un tiempo máximo de una semana.
2. Incubación de las lentes de contacto
En primer lugar, las lentes se sumergen durante 24 horas en la solución PBS con el objetivo de eliminar restos de otras soluciones que puedan interferir en los resultados del estudio.
La solución anteriormente preparada (TLS) se sonica durante 30 minutos a 37°C para asegurar su homogeneidad.
Las lentes de contacto se colocan en los pocillos de una placa ELISA y, en una cabina estéril, se pipetean 1,5 ml de TLS en cada uno de los pocillos.
Por último, las lentes se incubaron a 37°C con agitación constante (70 ciclos por minuto) durante 96 horas para que los lípidos se depositasen sobre las mismas.
3. Tratamiento de las lentes de contacto
En esta fase se procede a realizar la limpieza de las lentes de contacto previamente tratadas con la solución TLS.
De las 15 lentes “ensuciadas”, 3 sirven de control, por lo que no se tratan y pasan directamente a la fase de extracción de lípidos. El resto se tratan en grupos de tres lentes con las cuatro soluciones objeto de estudio según muestra la figura 25:
Control sólo lípidos
Solución All Clean Soft®
Solución Única Sensitive® Ever Clean®
Cleaning Drops®
Figura 25. Organización de las lentes y soluciones empleadas en el ensayo de lípidos en las placas ELISA.
El tratamiento de limpieza se realiza según las instrucciones de uso de las distintas soluciones que proporciona el fabricante con algunas salvedades: • En las soluciones únicas se elimina el frotado para evitar variaciones en los
resultados debidas a la distinta manipulación de las lentes.
• En las lágrimas artificiales, al ser un producto que se debe instilar directamente en el ojo, algo que no es posible realizar en un estudio “in vitro”, se realiza el mismo tratamiento que si de una solución única se tratase.
En todos los casos, las lentes de contacto se extraen de los pocillos con unas pinzas y se introducen en los portalentes cilíndricos. Estos portalentes se llenan con 7 ml de la solución testada. En el caso de los peróxidos, además de la solución se añade un comprimido neutralizante.
4. Extracción de los lípidos
Para la extracción de los lípidos adheridos a las lentes de contacto, se empleó el método de Folch [Folch et al., 1957], que emplea una mezcla de cloroformo:metanol en proporción 2:1.
El procedimiento cuenta con los siguientes pasos:
a) Se recogen las lentes control y las lentes tratadas con las distintas soluciones con unas pinzas de plástico y se enjuagan durante 3 segundos con solución PBS.
b) Se secan colocando la parte convexa sobre un papel de filtro durante 3 segundos.
c) Las lentes de depositan en tubos de ensayo para la extracción de lípidos (tubos A) a los que se añaden:
i) 3 ml de Cloroformo ii) 200 ml de solución BHT
d) Y se dejan en reposo durante tres horas. Transcurrido el tiempo, se agitan con mezclador vórtex durante 1 minuto y se añade 1 ml de metanol
e) Y se agita de nuevo con vórtex durante 1 minuto.
f) Las lentes de retiran y se lavan con 0,5 ml de metanol, que finalmente se recoge en el tubo. Seguidamente se agita con vórtex durante un minuto y se añaden 0,9 ml de AD, agitando de nuevo con vórtex durante 1 minuto.
g) Acto seguido se centrifugan los tubos a 1500 rpm durante 5 minutos, paso tras el cual se desecha la fase superior que queda en los tubos.
h) De los 3 ml de cloroformo restantes, 1,5 ml se traspasan a otro tubo de ensayo (tubo B).
i) Finalmente ambos tubos de cada una de las muestras se secan con Nitrógeno.
TUBO A – ANÁLISIS DEL COLESTEROL LIBRE
El contenido del Tubo A se re suspende en 200 ml de Hexano y se destina al análisis del colesterol libre.
TUBO B – ANÁLISIS DEL COLESTEROL OLEATO’
El contenido del tubo B se re suspende en 1 ml de hidróxido potásico 1M en etanol 95%. Los tubos cerrados se introducen en un baño a 90°C durante 50 minutos. Transcurrido el tiempo, se añade hexano y se vuelve a saponificar en baño a 90°C durante otros 50 minutos, añadiendo posteriormente hexano y agitando en mezclador vórtex durante 1 minuto.
El sobrenadante se traspasa a otro tubo (tubo B’) repitiendo de nuevo el proceso. El segundo sobrenadante de junta con el anterior en el tubo B’.
Finalmente las muestras se secan con nitrógeno y se re suspenden con 200 ml de hexano, destinándose al análisis del colesterol.
5. Cuantificación de los lípidos
Para la determinación del colesterol, se empleó la técnica de Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), realizándose la separación cromatográfica en columna de fase reversa Luna 5 µm C18 de 250 mm de largo x 4,60 mm de diámetro interno .
Para ello, los lípidos extraídos se diluyeron en la fase móvil de acetonitrilo:agua (95:5, v/v) durante los primeros 37 minutos, prosiguiéndose la elución con metanol absoluto, a un flujo de 1,2 ml/min. El efluente fue monitorizado por UV a 260 nm (pico correspondiente al colesterol).
Para la determinación del porcentaje de recuperación total del proceso se empleó un patrón estándar interno.
El colesterol cuantificado en todos los casos corresponde con colesterol libre. De este modo, en el Tubo A se cuantificó el colesterol libre real que corresponde al depositado en la lente. En el tubo B, la medida del colesterol libre corresponde al total de lípidos, ya que el colesterol oleato se transforma en colesterol libre por saponificación con potasa etanólica según la reacción química de la figura 26:
+𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 →𝐾𝑂𝐻
Figura 26. Reacción de saponificación de colesterol oleato.
Por lo tanto, la cantidad de colesterol oleato viene dada por la diferencia entre el colesterol libre que se obtiene en el tubo B y el obtenido en el tubo A.
En las figuras 27 y 28 se presenta un resumen del flujo de procesos para la lente control y para las lentes tratadas con las distintas soluciones respectivamente.
ENSAYO •CONTROL (3 muestras) INCUBACION DE LÍPIDOS •ENJUAGUE (PBS 24h) •SOLUCION DE TRABAJO 1,5 ml (Colesterol: 255µg) (Col. Oleato: 345µg) AGITACIÓN 37°C ;96h ; 70 ciclos/min ENJUAGUE (PBS 3 seg) SECADO Papel de Filtro TRATAMIENTO •SIN TRATAMIENTO EXTRACCIÓN •LENTE INCUBADA •CLOROFORMO 3ml + BHT 200µl •REPOSO 3h •AGITACIÓN 1min •METANOL 1ml •AGITACIÓN 1 min •LAVADO LENTE •0,5 ml Metanol •AGITACIÓN 1 min •AD 0,5 ml •AGITACIÓN 1min •CENTRIFUGADO •1500 r.p.m 5 min
•ELIMINACIÓN FASE SUPERIOR
•CLOROFORMO 3 ml TUBO A Y TUBO B 1,5 ml Cloroformo
CUANTIFICACION
Figura 28. Protocolo del estudio de eficacia de limpieza de lípidos.
ENSAYO
•LENTE INCUBADA + LAVADO (3 muestras)
INCUBACION DE LÍPIDOS •ENJUAGUE (PBS 24h) •SOLUCION DE TRABAJO 1,5 ml (Colesterol: 255µg) (Col. Oleato: 345µg) AGITACIÓN 37°C; 96h ; 70nciclos/min ENJUAGUE (PBS 3 seg) SECADO Papel de Filtro TRATAMIENTO •TRATAMIENTO 7 ml solución estudio s/ instrucciones de uso EXTRACCIÓN •LENTE INCUBADA •CLOROFORMO 3ml + BHT 200µl •REPOSO 3h •AGITACIÓN 1min •METANOL 1ml •AGITACIÓN 1 min •LAVADO LENTE •0,5 ml Metanol •AGITACIÓN 1 min •AD 0,5 ml •AGITACIÓN 1min •CENTRIFUGADO •1500 r.p.m 5 min
•ELIMINACIÓN FASE SUPERIOR
•CLOROFORMO 3 ml TUBO A Y TUBO B 1,5 ml Cloroformo