Distance-Based Phylogenetic Methods

ACEITES ESENCIALES Fundamento

La cromatografía de gases es importante para el análisis de la composición química de aceites esenciales, por su rapidez y confiabilidad, es una técnica de separación que se basa principalmente en fenómenos de partición entre una fase móvil gaseosa (helio, argón, hidrógeno, nitrógeno) y una fase estacionaria constituida por un líquido muy viscoso retenido en el interior de una columna cromatográfica.

La columna se coloca en un horno con temperatura regulable y programable, lo que permite al operador influir de forma decisiva en la separación de los componentes de la mezcla. El cromatógrafo se completa con un sistema de inyección, que permite introducir la muestra en la columna y un detector que muestra las diferentes sustancias a medida que van saliendo de la columna, una vez separadas. Las columnas cromatográficas utilizadas actualmente son de tipo capilar, están constituidas por un tubo de cuarzo flexible de diámetro muy pequeño (normalmente 0 ,2 5 mm) y longitud muy larga (desde 25 ó 60 m hasta 200 m); proporcionan alta resolución y permiten separar las mezclas multicomponentes de sustancias de diversa polaridad y/o isómeros (monoterpernos, sesquiterpenos, etc) (Montoya, 2010)33.

Para la identificación de los componentes del aceite esencial mediante CG se utiliza frecuentemente la comparación de sus tiempos de retención (tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición del pico cromatográfico) con los de los patrones.

Sin embargo, los tiempos de retención están fuertemente influenciados por numerosas variables, como la técnica de inyección, las variaciones de temperatura o flujo de los gases, el diseño de equipo, etc. Por este motivo ha sido necesaria la introducción de parámetros relativos como son los tiempos de retención relativos y los índices de retención.

La identificación de los componentes del aceite se realiza a través de la comparación de los índices de retención de Kováts para dos fases estacionarias, polar y apolar, de las sustancias patrones, con los índices de Kováts obtenidos para los componentes del aceite,

CARBOWAX 20M (polietilenglicol, fase polar) y OV-101 (DB-1) (polimetilsilicona, fase apolar) (Montoya, 2010)33.

La cuantificación y la identificación de los componentes de los aceites esenciales se realizó por Cromatografía de Gases acoplado a detectores FID y Espectrometría de Masas, en el laboratorio de investigación de aceites esenciales del Instituto de Investigación para La Industria Alimentaria, Carretera a Guatao, La Habana- Cuba; con la colaboración y asesoramiento del Doctor Jorge A. Pino Alea, experto investigador en Aromas de Alimentos y Aceites Esenciales.

Los análisis de la composición de los aceites esenciales, se realizaron por cromatografía de gases con un detector de ionización de llama (GC-FID) en un Konik 4000A (Konik, Barcelona) equipado con dos columnas capilares de sílice fundido de 30 m x 0,25 mm diámetro interno; una columna polar de HP-INNOWax (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) y la otra columna apolar de DB-5ms (J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.).

Para la identificación de sus componentes, se analizaron por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC-MS), usando un Hewlett Packard 6890, equipados con las mismas columnas interconectados con una Hewlett Packard masa selectivo detector 5973 (Agilent Tecnologías, Palo Alto, CA, EE.UU.). Parámetros de GC eran similar a GC-FID y temperatura de la interfase: 250 °C; temperatura MS source: 230 °C; MS cuadrupolo temperatura: 150 °C; energía de ionización: 70 eV; rango de masas: 35-400 m/z.

Procedimiento

 El intrumento calibrado con una mezcla de moléculas certificadas por Sigma Aldrih, se programó bajo las siguientes condiciones, para los dos tipos de columnas: programa de temperatura del horno, 60 °C (2 minutos), 60 a 220 °C (4 °C / min) y 220 ° C (5 minutos); como portador gas de helio, a una velocidad de flujo de gas 1 ml / min; inyector y del detector temperaturas 250 ° C, volumen de inyección de 0,2 µL y la relación de división 20: 1.

 Se colocó 1 mL de aceite esencial en el frasco de muestra del equipo y se ordenó el inicio con la inyección automática de la muestra y el desarrollo de la cromatografía de gases con detector FID; el equipo en automático desarrolló el perfil cromatogáfico de la muestra.

 El número de componentes de los aceites esenciales, se determinó en el perfil cromatográfico obtenido por cromatografía de gases con detector FID; el número de picos del cromatograma es equivalente al número de sus componentes de la muestra, porque cada pico es consecuencia de la señal de un componente del aceite esencial separado por cromatografía de gases. La cuantificación de la abundancia relativa de los componentes del aceite esencial, fue determinado por integración del área debajo de cada pico en comparación con el área total de los picos y el método de normalización con factores de respuesta de corrección basado en la agrupación de los componentes de aceites esenciales por sus grupos funcionales (Costa, 2008)50. Los porcentajes fueron determinados por valores medios de tres inyecciones por muestra.

 Para la identificación de sus componentes, la muestra se analizó por cromatografía de gases acoplado al detector de espectrometría de masas. Durante su desarrollo el equipo muestra el cromatograma del aceite esencial y el espectro de masas de cada componente. La muestra se corrió en la columna polar y apolar.  Los diferentes componentes separados por cromatografía de gases, se identificaron utilizando los índices de retención y espectros de masa de cada componente. Los índices de retención, calculada mediante la interpolación lineal con relación a los tiempos de retención de n-alcanos de C8-C24. Los índices de retención y los espectros de masas se compararon con los correspondientes datos estándar referenciales reportados en la literatura (Adams, 2001; Pherobase, 2015)51,52 y los espectros de masas de NIST 05, Wiley 6, NBS 75 k, y las bibliotecas Flavorlib del Doctor Jorge A. Pino Alea, experto investigador en Aromas de Alimentos y Aceites esenciales.

2.7DETERMINACIÓN DE TOXICIDAD EN Artemia salina Leach.