DNP/SS in Real Mobility Scenarios

Los liposomas se han convertido en un sistema de gran interés para la vehiculización de principios activos debido a su prolongado tiempo de circulación [221]. Los liposomas del tipo LUVs se han utilizado como modelo de membrana biológica debido a que los fosfolípidos adoptan una estructura similar a los fosfolípidos que se encuentran en la membrana citoplasmática [222].

Con el fin de simular un modelo de membrana biológica, diseñamos liposomas del tipo LUVs con diferente composición lipídica. Estos liposomas se obtuvieron mediante las técnicas de extrusión y sonicación para lograr obtener un tamaño de partícula entre 100-200 nm, similar a los dominios de las balsas lipídicas que conforman un punto de ensamblaje importante para el virus HIV-1.

Nuestro propósito principal es diseñar un modelo lipídico que contenga encapsulados péptidos inhibidores, que sirva de sistema de reconocimiento y a su vez impida la replicación del virus HIV-1. En este sentido, hemos obtenido liposomas del tipo LUVs que contienen los péptidos inhibidores P6-2 y VIR-P6-2. Este último está compuesto por una variante del péptido VIRIP derivado de la α-1 antitripsina, que inhibe la replicación del HIV-1 a concentraciones inferiores a las del T-20 [223]. El péptido VIR576 ((LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2) es una variante dimérica del VIRIP

(LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF) pero difiere en 4 aminoácidos y la sustitución de la metionina (M) por la cisteína (C), lo que promueve la

135

formación de un puente disulfuro intermolecular, aumentando considerablemente la capacidad anti-HIV-1 del péptido [224].

El péptido quimérico VIR-P6-2 fue sintetizado, purificado y caracterizado previamente en nuestro grupo de investigación con el propósito de aumentar la actividad del péptido P6-2.

Se prepararon liposomas del tipo LUVs que contienen encapsulados los péptidos P6-2 y VIR-P6-2. Los LUVs que contienen ambos péptidos se obtuvieron a partir de diferentes composiciones lipídicas: PC, PC-Chol, PC- Chol-SM, PC-Chol-GalCer y PC-Chol-SM-GalCer; para estudiar su influencia en la respuesta antiviral.

Los liposomas de PC son los más empleados en el sector farmacéutico debido a su fácil difusión en los tejidos y las células. Por otro lado, el colesterol es incapaz de formar bicapas por si solo, pero su presencia en la bicapa fosfolipídica confiere estabilidad a los liposomas. Dado su carácter anfipático, el colesterol orienta el grupo hidroxilo hacia la superficie de la bicapa e intercala el resto de la molécula entre las cadenas de ácido graso en el interior de la bicapa. Por otro lado, los esfingolípidos (SM y GalCer) mantienen el orden de las membranas celulares, conservando sus lípidos densamente empaquetados y con una movilidad reducida en el plano de la bicapa. Cuando el colesterol está presente en la bicapa, este tiende a ocupar los espacios situados entre las cadenas hidrocarbonadas saturadas de los lípidos, alineándose con los fosfolípidos y esfingolípidos [225].

Las preparaciones liposómicas se caracterizaron mediante el tamaño de las vesículas, el grado de incorporación de los péptidos y la determinación cuantitativa de fosfolípidos. Inicialmente se conoce la cantidad de lípido que se introduce para formar la bicapa lipídica, sin embargo, el problema que presenta la preparación de vesículas es que la cantidad de lípido varía durante el proceso de extrusión, y por lo tanto se desconoce la concentración

136

de liposomas después de la misma. Mediante la determinación del contenido de fosfatos fue es posible estimar las pérdidas y el contenido lipídico de las vesículas formadas. Posteriormente, el tamaño de las vesículas y la cantidad de péptido encapsulado se determinaron mediante las técnicas dispersión dinámica de la luz (Zetasizer Nano ZS) y HPLC en fase reversa. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Caracterización de los liposomas que contienen los péptidos P6-2 y VIR-P6-2. (media ± SD, n=3).

Liposomas Péptidos Tamaño (nm) Polidispersión Contenido fosfatos (mM) Concentración de péptido (mM) PC - 134,2 ± 2,52 0,0066 ± 0,048 3,19 - P6-2 145,1 ± 1,6 0,330 ± 0,083 4,90 0,163 VIR-P6-2 133,7 ± 2,24 0,069 ± 0,013 4,74 0,114 PC-Chol - 135,0 ± 1,16 0,096 ± 0,037 2,72 - P6-2 193,9 ± 4,2 0,314 ± 0,052 2,63 0,086 VIR-P6-2 145,1 ± 1,36 0,076 ± 0,029 5,75 0,152 PC-Chol- SM - 143,4 ± 2,55 0,101 ± 0,060 4,63 - P6-2 503,6 ± 19,8 0,716 ± 0,165 4,19 0,13 VIR-P6-2 161,7 ± 2,35 0,079 ± 0,031 6,60 0,174 PC-Chol- GalCer - 145,9 ± 1,18 0,066 ± 0,039 2,17 - P6-2 717,2 ± 80,61 0,787 ± 0,226 2,99 0,417 VIR-P6-2 253,6 ± 2,1 0,469 ± 0,081 3,36 0,088 PC-Chol- SM- GalCer - 145,8 ± 0,46 0,123 ± 0,052 5,50 - P6-2 279,8 ± 3,3 0,751 ± 0,055 3,83 0,499 VIR-P6-2 152,8 ± 2,97 0,129 ± 0,036 6,22 0,185

137

En general las formulaciones obtenidas con el péptido P6-2 poseen un tamaño y polidispersión mayor que las del péptido VIR-P6-2. Las diferencias en los tamaños se deben principalmente al método de obtención empleado. El péptido VIR-P6-2 se pudo homogenizar y encapsular en los LUVs eficazmente mediante el método de extrusión. Esta técnica permite obtener pequeñas poblaciones de tamaños de partículas dependiendo del tamaño de poro del filtro utilizado, siendo útil en la encapsulación de solutos lábiles, péptidos y proteínas [226]. Sin embargo, los LUVs que contenían el P6-2 se utilizó el método de sonicación realizándose 10 ciclos de calentamiento (5 minutos) seguido la sonicación (2 minutos). Este último método se empleó, debido a que previamente se ensayaron todas las composiciones de liposomas mediante el método de extrusión, obteniéndose un bajo contenido de fosfolípido y una baja concentración de péptido encapsulado. Esto se puede deber a una posible asociación del P6-2 con los liposomas, quedando la cadena peptídica tanto en el espacio acuoso interno y externo, pudiendo en este último caso dar lugar a la agregación de los liposomas dificultando su extrusión.

En todos los casos, la cantidad de péptido encapsulada con respecto al contenido de fosfatos fue suficiente para realizar los ensayos de fusión celular y susceptibilidad anti-HIV-1 que se describirán más adelante.

4.2.4 Estudio de la viabilidad celular y actividad de inhibición de los