EDUCATIONAL METHOD

Azul de toluidina, solución 0,1M.

Azul de toluidina 3,05 g

Agua destilada 100,0 mL

En un matraz aforado de 100,0 mL disolver el azul de toluidina y aforar a volumen con el agua.

Calcio cloruro, solución 0,01M.

Cloruro de calcio anhidro (peso molecular 110,99) 1,199 g

Agua destilada 1,0 L

Disolver el cloruro de calcio en agua y llevar a un litro.

Etanol 70 %.

Alochol etílico absoluto 70,0 mL

Agua destilada 100,0 mL

Solución de desoxicolato de sodio al 0,5% en agua destilada estéril.

Desoxicolato de sodio 0,5 g

Agua destilada estéril 99,5 mL

Disolver el desoxicolato de sodio en agua destilada estéril.

Solución reguladora de Fosfatos pH 7.2, (solución concentrada).

Fosfato monobásico de potasio 34,0 g

Agua destilada 1,0 L

Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2, con solución de hidróxido de sodio 1N, aforar con agua a un litro. Esterilizar la solución a 121°C±1,0°C y conservar en refrigeración.

Solución de trabajo: Tomar 1.25 mL de la solución anterior (solución

concentrada) y transferirlos a un matraz volumétrico de un litro, aforando con agua; después de distribuir en matraces o tubos, los volúmenes especificados en

cada monografía, se debe esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes finales y el pH, deben ser iguales a los iniciales.

Reactivo de Kovac’s.

p-dimetilaminobenzaldehído 5,0 g

Alcohol amílico (normal) 75,0 mL

HCI concentrado 25,0 mL

Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal y adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4°C.

Para la prueba de indol:

Adicionar de 0,2 a 0,3 mL del reactivo anterior, a 5 mL del cultivo de bacterias en caldo triptona. Destapar el tubo e inclinarlo para permitir la entrada de una mayor cantidad de oxígeno ambiental que ayude a la reacción. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo en la superficie del tubo.

Principio de acción

El triptofano es un aminoácido, que por acción de la triptofanasa lo degrada en indol, escatol y ácido indolacético . Un intermediario importante es el ácido indolpirúvico, que al desaminarse forma el indol. En caso de que se descarboxile el ácido indolacètico, se forma el escatol

Prueba del Ortonitrofenil galactósido (ONPG).

Reactivos

Buffer de fosfato de sodio, 1M, pH 7. o-nitrofenil-β-galactosido (ONPG), 0,75 M Solución fisiológica

Tolueno

Realizar la prueba a partir de agar-hierro de Kligler (KIA) ó agar triple azúcar hierro (TSI). Emulsificar un asa cargada de desarrollo bacteriano con 0,5 mL de solución fisiológica hasta producir una suspensión abundante. Añadir a dicha suspensión una gota de tolueno y mezclar enérgicamente unos segundos para liberar la enzima de las células bacterianas. Añadir a la suspensión igual cantidad de solución buffer de ONPG y colocar la mezcla en baño de agua a 37ºC.

Interpretación. La velocidad de hidrólisis del ONPG a ortonitrofenol puede ser rápida en algunos organismos, produciéndose una reacción que se visualiza por la

aparición de un color amarillo en 5 a 10 minutos. La mayoría de las pruebas son positivas en una hora, sin embargo, las reacciones no se deben interpretar como negativas antes de las 24 horas de incubación. El color amarillo indica que el organismo ha producido ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por acción de la β-galactosidasa.

Principio de acción

El ortonitrofenil galactósido (ONPG) es estructuralmente similar a la lactosa, salvo que la glucosa ha sido substituida por el ortonitrofenil.

Por acción de la β-galactosidasa, el ONPG se hidroliza en dos residuos, galactosa y ortonitrofenol. El ONPG es un compuesto incoloro mientras que el ortonitrofenol es amarillo, lo cual es una evidencia de la hidrólisis.

Las bacterias fermentadoras de lactosa poseen dos enzimas, permeasa y β- galactosidasa, requeridas para la producción de ácido a partir de la fermentación de lactosa. La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa penetre en la célula bacteriana, donde la β-galactosidasa puede romper la unión galactósido, produciendo glucosa y galactosa. Los no fermentadores de lactosa carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir ácido a partir de lactosa. Algunas especies bacterianas aparecen como no fermentadoras de lactosa pues carecen de permeasa pero si tienen β-galactosidasa y dan una prueba de ONPG positiva. Los llamados fermentadores tardíos de lactosa pueden demorar en producir ácido a partir de la lactosa debido a una lenta actividad de permeasa. En estos casos una prueba de ONPG positiva puede proveer una identificación rápida de los fermentadores tardíos.

Reactivo de oxidasa.

N-Tetrametil-p-Fenilendiamina 0,5 g

Agua destilada 100,0 mL

Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días. Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de

Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii).

Interpretación. La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto.

Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria aerobia, tranfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados.

La prueba de citocromo oxidasa utiliza el diclorhidrato de Tetrametil-p- Fenilendiamina, que acúa como aceptor artifical de electrones, sustituyendo al oxígeno. La p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.

Plasma de Conejo.

Emplear plasma de conejo liofilizado rehidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticoagulante que se debe de utilizar para obtener el plasma es ácido etilendiaminotetracético (EDTA) al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado, diluir con agua estéril en proporción 1:3. Puede utilizarse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse plasma de sangre citratada.

Principio de acción

El plasma en presencia de la enzima coagulasa bacteriana, forma un coágulo de fibrina. El mecanismo esta dado porque la protrombina en presencia de sales de calcio y la enzima trombocinasa (tromboplastina), forman la trombina y ésta última al encontrarse frente al fibrinógeno, forma un coágulo de fibrina.

La técnica para determinar la coagulasa ligada o factor de agregación, se realiza en un portaobjetos. Es responsable de la absorción del fibrinógeno, el cual precipita sobre los estafilococos, propiciando la agregación de estos microorganismos, observándose una aglutinación celular. En este caso, el factor de agregación, transforma el fibrinógeno en fibrina de manera directa, no toman parte los factores plasmáticos, tampoco se inhibe por los anticuerpos contra la coagulasa libre.

La prueba de la coagulasa en tubo, detecta tanto la coagulasa libre como la ligada; la coagulasa libre extracelular, reacciona con una sustancia denominada factor de reacción de la coagulación, que se abrevia CRF, (sustancia termoestable parecida a la trombina), formando un complejo, el cual transforma el fibrinógeno en fibrina, liberando péptidos. En este caso el CRF, reacciona con la coagulasa, sin necesitar iones de calcio para formar el coágulo.

Rojo de metilo 0,2 g

Etanol al 95 % 300,0 mL

Agua destilada 200,0 mL

Mantener el reactivo en refrigeración cuando no se utilice, el reactivo es estable de 2 a 3 semanas.

Prueba de Rojo de metilo

Transferir 2.5 mL del cultivo a probar con 48 h. de incubación a un tubo de ensayo. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo e interpretar el color de inmediato: Una coloración roja indica producción de acidez por lo que la prueba es positiva.

Salina isotónica, solución.

Cloruro de sodio 8,5 g

Agua destilada 1,0 L

Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos.

Tartárico ácido al 10%.

Ácido tartárico 10,0 g

Agua destilada 100,0 mL

Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121°C durante 15 minutos, o bien por filtración a través de una membrana de 0,45 µm.

Tris-(hidroximetilaminometano), solución amortiguadora 0,05M.

Tris-hidroximetilaminometano, (peso molecular 121.1), pH 9,0 6,055 g

Agua destilada 100,0 mL

Disolver el Tris-(hidroximetilaminometano) en un matraz volumétrico de 100,0 mL y llevar a volumen con el agua.

Voges-Proskauer, reactivos (VP).

alfa-naftol 5,0 g Alcohol absoluto 100,0 g VP 2 Hidróxido de potasio 40,0 g Agua destilada cbp 100,0 mL Prueba de Voges-Proskauer (VP):

Transferir 1 mL del cultivo a probar, con 48 h. de incubación, a un tubo de ensayo. Después adicionar 0,6 mL de la solución VP 1 y 0,2 mL de la solución VP 2. Agitar después de la adición de cada solución.

Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. Dejar a temperatura ambiente y leer los resultados después de 4 h. de adicionados los reactivos. El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva.

Nitritos, reactivos para la determinación de.

Reactivo A Alfa-naftilamina 0,5 g Àcido acètico 5N 100,0 mL Reactivo B Àcido sulfanìlico 1,0 g Àcido acètico 5N 125,0 mL Reactivo C Alfa-naftol 1,0 g Àcido acètico 5N 200,0 mL

Solución de sulfato de cadmio al 20%

Colocar granallas de zinc en solución de sulfato de cadmio al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de cadmio, adicionando ácido clorhídrico 1N.

TINCIONES