The effect on technological progress

Els enzims CDK4 i CDK6, tal i com s’ha vist en el capítol anterior, són considerats bones dianes terapèutiques no només per la parada en la progressió cel·lular que implica la seva inhibició, sinó pels efectes metabòlics que aquesta inhibició comporta. Durant dècades s’han estat avaluant i cercant nous inhibidors de CDK4 i CDK6 per a la pràctica clínica i encara a hores d’ara no hi ha molts resultats prometedors. La inespecificitat de la majoria dels compostos i la gran quantitat d’efectes secundaris que se’n deriven provoquen que la majoria dels tractaments amb aquests inhibidors no tinguin gaire èxit (Toogood et al., 2005). Per tant en aquest capítol ens vam proposar trobar nous inhibidors sintètics pels enzims CDK4 i CDK6 que poguessin millorar els ja existents fins al moment, i que es poguessin emprar com a teràpies coadjuvants en tractaments antitumorals segons el transfons genètic i metabòlic tumoral i la dependència de la línia tumoral vers aquests enzims.

En la primera estratègia utilitzada es van aprofitar les dades obtingudes dels models de dinàmiques moleculars desenvolupats al grup d’investigació del Dr. Jaime Rubio per tal de trobar altres candidats l’estructura dels quals s’ajusti millor al farmacòfor identificat per tal d’inhibir els complexes ciclina D–CDK4 i CDK6. Entre els candidats trobats, es van escollir una bateria de 8 composts que diferien en la seva estructura principal, els quals van ser testats mitjançant assajos cinasa per tal de veure quins d’ells presentaven millors característiques com a possibles inhibidors de l’activitat cinasa de la CDK4 i CDK6. Per tal de dur a terme els estudis d’inhibició de CDK4 i CDK6 amb assajos cinasa, es van utilitzar enzims immunoprecipitats de cèl·lules HCT116 i, fent servir com a reactiu ATP radioactiu, el grau d’inhibició va ser valorat posteriorment per autoradiografia.

Amb un screening a altes concentracions (1 mM) es van escollir tres compostos (D, F i J) com els millors inhibidors de CDK6 i va ser amb aquests compostos amb els que es va seguir tot l’estudi molecular.

Per tal d’estudiar els efectes moleculars dels inhibidors seleccionats es van fer estudis de selectivitat d’acció contra les diferents cinases encarregades de regular el cicle cel·lular. Els tres inhibidors seleccionats, D, F i J presentaren activitat inhibitòria de la CDK6 in vitro en assajos cinasa a 25, 10 i 10 μM. A més, a aquestes concentracions també s’inhibia significativament l’activitat de CDK4 en assajos cinasa. Aquesta inhibició tampoc semblava depenent del tipus de ciclina associada a CDK4 o CDK6, ja que quan les immunoprecipitacions es van efectuar amb anticossos per les diferents ciclines D, els compostos van presentar els mateixos nivells d’inhibició sobre aquestes cinases. A més a més i de forma addicional, a aquestes mateixes concentracions els tres compostos no van exercir una inhibició significativa sobre l’activitat de CDK1 i CDK2.

A continuació, i un cop descrita l’activitat inhibitòria contra CDK4 i CDK6 en assajos cinasa es van portar a terme assajos de proliferació cel·lular. Per aquesta tasca es va utilitzar una sèrie de diferents línies cel·lulars valorant-ne la viabilitat front a tractaments dels tres compostos d’interès a diferents temps. Els criteris utilitzats per triar les diferents línies cel·lulars van ser diversos: la línia d’adenocarcinoma de colon HCT116 perquè posseeix un pRb inalterat i no és sensible a l’acció de l’inhibidor natural p16INK4a, la línia de colonòcits humans no tumorals NCM460 per tal de testar la selectivitat dels compostos vers a les cèl·lules tumorals; dues línies de adenocarcinoma de mama, MCF-7 i SKBR-3 degut a que expressen diferents nivells del gen Her2 i aquest tret les podria fer més o menys sensibles a inhibidors de CDK4 i CDK6; i la línia de ronyó de mico COS-1 perquè té el pRb inactiu i s’hauria de mostrar menys sensible a inhibicions dels enzims CDK4 i CDK6.

Les IC50 dels tres productes assajats es van establir en el rang de milimolar per totes les línies cel·lulars. No obstant, sembla que aquests compostos podrien tenir certa selectivitat vers les línies tumorals, ja que els efectes sobre les cèl·lules HCT116 van ser superiors als efectes sobre la seva línia control no tumoral, els colonòcits humans NCM460. A més a més, els productes van mostrar una activitat citotòxica major en la línia tumoral de mama SKBR3, que presenta alts nivells de HER2, que en la línia tumoral de mama MCF-7, on els nivells d’HER2 són menors (IC50= 750 vs. 900, 1100 vs. 1480 i 850 vs. 1080 μM en SKBR-3 i MCF-7, respectivament i pels productes D, F i J). Finalment, els resultats sobre la línia cel·lular COS-1 (amb un pRb constitutivament inactiu) van corroborar que l’acció d’aquests productes succeeix via pRb i ens van permetre descriure els compostos D, F i J com a útils vers cèl·lules on el pRb es manté inalterat.

Degut als alts valors de l’IC50 en les diferents línies tumorals es va sintetitzar un èster del producte F per tal de millorar l’entrada del producte a través de la membrana plasmàtica. Amb aquesta modificació, la seva IC50 va disminuir a 100 μM respecte als 1320 μM del seu derivat actiu en HCT116. Això va suggerir que la síntesi de derivats més lipòfils dels productes D, F i J milloraria la seva eficàcia en cèl·lules en cultiu.

A continuació, i tal com es va fer al capítol 1, es va estudiar l’estat de fosforilació del pRb. Amb aquests experiments es pretenia discernir si aquests compostos, tot i a aquestes dosis tan elevades, serien capaços d’exercir la funció suggerida als assajos cinasa un cop arribaven a la seva diana. Només en aquest cas, en un futur proper es plantejaria la síntesi de derivats més lipòfils per millorar la seva entrada a la cèl·lula. Afortunadament, els resultats van fer evident que els tres compostos disminuïen la fosforilació de pRb de manera significativa.

La caracterització d’aquests nous inhibidors ens obre noves portes en la recerca de modificacions químiques estructurals que permetin mantenir l’esquelet de compostos amb potencial inhibidor i els punts d’unió essencials per la unió amb les molècules d’interès (caps de grup), per així trobar noves famílies de compostos més lipòfils, amb una activitat inhibitòria de CDK6 i CDK4 que permetin pertorbar el cicle cel·lular i així interrompre la progressió tumoral.