Recientemente se ha propuesto una hipótesis en la cual la ruta del RNA de interferencia (RNAi) podría estar implicada en el mecanismo de patogénesis de enfermedades debidas a la expansión de repeticiones de trinucleótidos.
En el caso general de enfermedades debidas a una expansión de repeticiones de trinucleótidos (CGG, CCG, CTG y CAG) su transcripción promueve la formación de horquillas de RNA de doble cadena (dsRNA). Según esta hipótesis los dsRNA se convertirían en una fuente de microRNAs (miRNAs) y/o pequeños RNAs interferentes (siRNAs). Estos RNAs regulan negativamente la traducción o median el silenciamiento post-transcripcional del RNA de los genes que contienen regiones d(CN*G)>7 (N*=cualquier base nitrogenada complementaria a N) respectivamente. La eliminación de las proteínas codificadas por esos genes puede contribuir al inicio de la enfermedad debida a estas expansiones (Figura 5.1).
Resultados
Figura 5.1. Mecanismo molecular hipotético que contribuiría en la patogénesis de enfermedades debidas a expansiones de repeticiones de trinucleótidos. (1) Las secuencias que contienen la
expansión de trinucleótidos (CNG, N= T, G, C o A) al transcribirse generan horquillas de RNA de doble cadena (dsRNA) en las cuales las pares de bases N-N están flanqueadas y estabilizadas por dos pares de bases consecutivas tipo Watson-Crick C-G (Mooers et al., 2005). (2) Los dsRNA son una fuente de microRNAs (miRNAs) y/o RNAs pequeños interferentes (siRNAs). (3) Estos RNAs silencian los genes que contienen regiones d(CN*G)>7 (la longitud de los siRNA es de 21-26 nucleótidos, N* es complementario a
N). (4) La expansión de repeticiones del triplete puede eliminar proteínas codificadas por esos genes y contribuir al inicio de la enfermedad. Figura tomada de Malinina, 2005.
En el caso de la DM1 la expansión del triplete es (CTG)n que origina una secuencia cercana a (GCN)n. La secuencia GCN codifica para alaninas (Ala). Hemos visto que el gen MBNL1 es un componente muy importante en la ruta de patogénesis de la DM1 siendo su pérdida de función uno de los principales detonantes de la enfermedad (Kanadia et al., 2003a). La secuencia aminoacídica de MBNL1 contiene una región (Ala)7 que es codificada por la secuencia nucleotídica GCNGCNGCNGCNGCNGCNGCN y estos transcritos podrían ser reconocidos por la maquinaria del RNAi que silenciaría el gen MBNL1. De modo que las expansiones CTG hipotéticamente también podrían afectar a los niveles de mRNA de MBNL1 (Malinina, 2005).
Pretendimos observar en las moscas modelo si la maquinaria del RNAi contribuía en la patogénesis de la DM1. Según esta hipótesis la transcripción de estas
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expansiones de repeticiones CTG formaría horquillas de dsRNA que se convertirían en siRNAs y/o miRNAs. Estos RNAs degradarían los transcritos de mbl por la región rica en CNG y/o inhibirían la traducción, respectivamente. Comprobamos si muscleblind contenía regiones ricas en CNG y observamos que las variantes mblB y mblC presentaban 15 y 10 repeticiones CNG, respectivamente. Decidimos analizar los transcritos de la isoforma mblC porque esta variante se detectó en todos los estadíos de Drosophila mientras que mblB solamente se detectó en larva y pupa temprana dificultándonos la extracción del RNA (Vicente et al., 2007). Comprobamos los niveles de transcritos mblC en moscas que expresaban las expansiones de repeticiones (CTG)480 porque esperábamos que los siRNAs degradaran los transcritos mblC por la región rica en CNG. Para detectar si se producía una disminución de los transcritos mblC diseñamos tres oligonucleótidos que reconocieran la secuencia complementaria localizada en el exón 7, intrón 10 y exón 11 (Figura 5.2). Con la pareja de cebadores dirE7 y revE11 detectamos el RNA maduro que debe localizarse en el citoplasma, donde se encuentra la maquinaria del RNA interferente. Comprobamos si los niveles de RNA estaban disminuidos en moscas que expresaban las (CTG)480. Como control utilizamos el cebador dirI10 y el revE11 permitiéndonos detectar los transcritos mblC inmaduros, que se localizan en el núcleo. Este control indica si la disminución del transcrito maduro en moscas que expresan (CTG)480 se debe al RNAi o a la reducción de la transcripción de muscleblind debido a la expresión de las (CTG)480.
E7
E9
E10
E11
dirI10 Ala 856 pb 489 pb revE11 dirE7Figura 5.2. Localización de los cebadores para detectar los transcritos maduros e inmaduros de mblC. La región rica en alaninas está codificada en el exón 11 (Ala). El cebador directo que se localiza en
el exón 7 (dirE7) y el reverso en el exón 11 (revE11) al utilizarse juntos en una reacción de RT-PCR nos revela la cantidad de RNA maduro mblC que se expresa en las moscas. En un gel de agarosa se detecta una banda de 489 pb. La utilización del cebador directo del intrón 10 (dirI10) y el reverso en el exón 11 (revE11) amplifica el RNA inmaduro de los transcritos mblC. En un gel de agarosa se detecta una banda de 856 pb.
Hicimos una extracción de RNA de moscas de diferentes genotipos: expresando en músculo el transgén UAS-(CTG)480 y UAS-(CTG)60 y como control
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de muscleblind eran distintos entre sexos. Hicimos una reacción de RT-PCR utilizando las dos parejas de cebadores en reacciones separadas.
Comprobamos mediante electroforesis en gel de agarosa los productos de la RT-PCR y cuantificamos cada una de las bandas (Figura 5.3).
1 2 3 4 5 6 MPM 35 38 51 36 856 pb (mRNA inmaduro) 489 pb (mRNA maduro) Rp49
Figura 5.3. RT-PCR de mblC a partir de RNA total de moscas. (1) UAS-(CTG)480/ + con cebadores dirI10-revE11, (2) UAS-(CTG)480/ + con cebadores dirE7-revE11, (3) Mhc-GAL4/ +; UAS-(CTG)60/ + con cebadores dirI10-revE11, (4) Mhc-GAL4/ +; UAS-(CTG)60/ + con cebadores dirE7-revE11, (5) Mhc-GAL4/ +; UAS-(CTG)480/ + con cebadores dirI10-revE11 y (6) Mhc-GAL4/ +; UAS-(CTG)480/ + con cebadores dirE7-revE11). El marcador de peso molecular (MPM). Rp49 como control de carga. Cada banda muestra su correspondiente valor de intensidad.
Observamos diferencias entre la banda del mRNA inmaduro (carrera 3) y maduro (carrera 4) procedente de moscas que expresaban 60 repeticiones. En cambio, detectamos la misma intensidad de cDNA procedente de los transcritos inmaduros (carrera 5) que de los transcritos maduros (carrera 6) de mblC de moscas que expresaban (CTG)480. Según esta aproximación sugerimos que la expresión de UAS-(CTG)480 en músculo no interfería, vía la maquinaria RNAi, con los transcritos de
al menos mblC.
La comparación entre los dos genotipos no mostró diferencias entre los mRNA maduros (carrera 4 y 6) pero sí entre las bandas de mRNA inmaduro. Estas diferencias de intensidad entre la banda de mRNA inmaduro procedente de moscas que expresaban (CTG)60 (intensidad 51) (carrera 3) y de moscas que expresaban (CTG)480 (intensidad 35) (carrera 5) eran reproducibles (carreras 5 y 7 en Figura 5.4 con una intensidad de 94 y 74, respectivamente) con una amplificación equivalente de Rp49.
Resultados 1 2 3 4 5 6 7 8 MPM 856 pb (mRNA inmaduro) 74 45 45 94 52 60 45 45 489 pb (mRNA maduro) Rp49
Figura 5.4. RT-PCR de mblC a partir de RNA total de moscas. (1) yw con cebadores dirI10-revE11,
(2) yw con cebadores dirE7-revE11, (3) UAS-(CTG)480/ + con cebadores dirI10-revE11, (4) UAS-(CTG)480/
+ con cebadores dirE7-revE11, (5) Mhc-GAL4/ +; UAS-(CTG)60/ + con cebadores dirI10-revE11, (6) Mhc-
GAL4/ +; UAS-(CTG)60/ + con cebadores dirE7-revE11, (7) Mhc-GAL4/ +; UAS-(CTG)480/ + con cebadores dirI10-revE11 y (8) Mhc-GAL4/ +; UAS-(CTG)480/ + con cebadores dirE7-revE11. El marcador de peso
molecular (MPM). Rp49 como control de carga. Cada banda muestra su correspondiente valor de intensidad.
En la Figura 5.4 se observa que en las moscas control (no expresan expansiones) las bandas del mRNA inmaduro (carreras 1 y 3) muestran igual intensidad (en torno a 45) que las bandas del mRNA maduro (carreras 2 y 4). Este dato demuestra que todos los transcritos inmaduros se procesan hasta convertirse en maduros. En cambio, las muestras que expresaban repeticiones mostraban diferencias de intensidad entre las bandas de mRNA inmaduro (carreras 5 y 7) y las de mRNA maduro (carreras 6 y 8).
De estos resultados pudimos concluir que en moscas que expresan las expansiones CTG no se puede afirmar que haya una interferencia clara pero sí un incremento en la cantidad de pre-mRNAs y mRNAs de mblC. Sugerimos varias propuestas que expliquen estos efectos producidos al expresar RNAs CUG:
■ Un incremento en la transcripción de muscleblind. ■ Un incremento de la estabilidad de los transcritos mblC.
■ Una disminución en la exportación de los transcritos mblC al citoplasma por un efecto directo o indirecto. (Véase Apartado 4 de Discusión).
Discusión