La realización del ciclo de PGD sigue las mismas pautas que el de un ciclo FIV convencional hasta día+3 (Carrillo et al., 2007). La técnica de inseminación que se realiza es siempre ICSI, por el riesgo de contaminación con ADN extraño (espermatozoides y células de la granulosa).
4.4.6. Biopsia embrionaria
La biopsia embrionaria se lleva a cabo siguiendo el protocolo habitualmente empleado por los embriólogos de esta Unidad para los ciclos de PGD (Peciña et
al., 2010, Fernández et al., 2013).
Se realiza en la mañana del d+3, en estadio de células, mediante el uso de tecnología láser (Octax laser). Para ello se realiza un pequeño orificio en la zona pelúcida de los preembriones disponibles y se aspira suavemente una o dos blastómeras, Previamente se coloca al preembrión en un medio libre de calcio y magnesio (G-PGDTM Vitrolife) para su descompactación y así facilitar la extracción de las mismas. Se debe realizar en el menor tiempo posible para que
la descompactación no se haga irreversible.
El equipo y material empleado para la biopsia consiste en:
- Microscopio invertido Olympus con micrmanupulación - Microinyector Eppendorf Cell Tram Vario*, para aspiración - Microinyector Eppendorf Cell Tram Oil, para sujeción - Equipo Laser Olympus
- Micropipetas Biopsia MBB-BP-SM-30 - Micropipetas Holding MPH-SM-30 - Medio G- DGP (Vitrolife)
- Placas de biopsia (Nunc)
Los criterios de calidad embrionaria utilizados para realizar la biopsia en d+3 son: prembriones de ≥ de 5 células con < de 35% de fragmentación y sin multinucleación en d+2 (Alikani et al., 1999, 2000).
En cuanto al número de blastómeras a biopsiar:
-Si los embriones en Día + 3 tienen más de 7 células se extraen 2. -Si los embriones en Día + 3 tienen 5 ó 6 células se extrae 1.
-Si tiene 4 células o menos en D+3, no se biopsia. (Embrión bloqueado)
Una vez realizada la biopsia, si se va a llevar a cabo un protocolo de FISH, utilizado en los comienzos del programa PGD en nuestra Unidad para sexado de embriones en patologías ligadas al cromosoma X, se realiza fijación de blastómeras mediante el método descrito por Dozortsev, con algunas modificaciones propias. De ese modo, las blastómeras son depositadas sobre un portaobjetos en una gota de 3 microlitros de TWEEN 20, bajo estereomicroscopio.
Preparación de TWEEN 20:
- 2.5 microlitros de Tween-20 (Sigma) - 2.5 mililitros de agua destilada - Agitar
- 25 microlitros de HCl 1 N
- (1 ml de HCl 1 N 83 microlitros de HCl al 37% (MERCK) + 917
microlitros de agua destilada)
A continuación, se traslada el porta al microscopio invertido y se controla en todo momento la liberación del núcleo de los restos citoplasmáticos, hasta la completa evaporación de la gota. Bajo microscopio invertido se hace una marca con rotulador en la proximidad del núcleo, y después se marca la posición por la zona inferior del portaobjetos con un lápiz marcador de punta de diamante. A continuación, se fija la blastómera a la superficie del porta mediante la adición de Carnoy (metanol y ácido acético glacial 3:1). Por último, con el microscopio en el que posteriormente se realiza el análisis del FISH, se miden las coordenadas de la marca realizada con el lápiz de diamante, con el fin de ubicar la posición aproximada de la blastómera.
Si lo que se va a llevar a cabo es un protocolo basado en PCR, cada blastómera
es depositada en una gota de 10 µL de medio, sobre placa de Petri. A continuación, con la ayuda de capilares de 75 micras de grosor, mediante aspiración suave las blastómeras son sometidas a un rápido lavado con tampón de disociación, cuya preparación se detalla a continuación:
Tampón de disociación: 0.8 g de NaCl 0.02 g de KCl 0.005g de NaH2PO4 0.1 g de glucosa 0.01 g Phenol red Agua Milli-Q c.s.p 100ml
Autoclavar y alicuotar. Añadir una cucharadita de BSA justo antes del uso
Finalmente, tras tres lavados consecutivos, las blastómeras son transferidas de
forma individual a microtubos de 0.2 mL que contienen 2.5 µL de tampón de lisis. Una vez entubadas, son almacenadas a –80ºC durante al menos 30 minutos. 4.4.7. Análisis genético
Inicialmente para determinar el sexo en las enfermedades ligadas al cromosoma X se realiza mediante FISH.
Posteriormente se optimiza el método de diagnóstico molecular basado PCR, al igual que para el resto de enfermedades monogénicas.
La mayoría de los protocolos han sido optimizados por las genetistas de la UGCGRMF previo a la incorporación en el programa de cada una de las enfermedades.
Tanto las adaptaciones de protocolos previamente publicados, como todas las optimizaciones de nuevos métodos se desarrollan en los apartados 4.5 al 4.8. 4.4.8. Transferencia y congelación de preembriones
Una vez diagnosticados, los preembriones sanos son transferidos al útero, y nunca más de dos, con el fin de evitar grandes gestaciones múltiples (Carrillo
et al., 2007). Las transferencias de las punciones del viernes se realizan en
d+5, miércoles. Las transferencias de las punciones del lunes se realizan en d+4 (viernes) o d+5 (sábado), en función del tiempo de diagnóstico.
La determinación de la β-HCG se indica sobre el día 9º tras la transferencia. Manteniendo el tratamiento con Progesterona micronizada hasta la próxima consulta o menstruación.
En caso de tener preembriones supernumerarios o sobrantes, en caso de no tener disponible el diagnóstico en d+5 o cuando exista riesgo de síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO), se congelan los preembriones mediante el método de vitrificación (Irvine) para intentos posteriores (este método de vitrificación es el único medio comercial disponible en el año 2005).
En caso de gestación, se recomienda a todas las pacientes la realización de DP, y posterior seguimiento del recién nacido por parte de su pediatra. Se ofrece la realización del DP en la UGCGRMF, independientemente de su lugar de procedencia.
4.5. PROTOCOLO DE FISH PARA ENFERMEDADES LIGADAS AL