Para llevar a cabo la desacetilación selectiva de los compuestos fenólicos analizados, previamente fue necesario llevar a cabo un proceso de peracetilación, descrito en el apartado III. 17.1 de Materiales y Métodos.
IV.6.2.1. Desacetilación del hidroxitirosol peracetilado
La O-desacetilación del hidroxitirosol peracetilado 2 se efectuó usando un alcohol alifático (MeOH) como disolvente y el sobrenadante liofilizado de la cepa Bacillus sp. HR21-6. La reacción fue completamente regioselectiva en las posiciones fenólicas, y dio un derivado monoacetilado 3 en la posición alifática con excelentes rendimientos (90%) (Figura 31). El derivado 3 es un compuesto natural presente en el aceite de oliva virgen extra (Brenes et al. 1999).
Figura 31. Desacetilación regioselectiva del hidroxitirosol peracetilado 2 catalizada por el extracto enzimático de Bacillus sp. HR21-6, dando como resultado hidroxitirosol monoacetilado 3
IV.6.2.2. Desacetilación del DHPG peracetilado
En la desacetilación del DHPG peracetilado el grupo acetoxi en la posición primaria permaneció intacto, mientras que el grupo acetoxi en la posición bencílica fue sustituido por el grupo alcoxi correspondiente. Esto dio como resultado la síntesis de derivados eterificados monoacetilados 6a-d (Figura 32). Un factor para tener en cuenta es que si las reacciones se producían en presencia del alcohol alifático MeOH como disolvente y el sobrenadante liofilizado de Bacillus sp HR21-6 como biocatalizador se llegaba a una conversión completa del DHPG peracetilado (compuesto 5) al compuesto 6a con rendimientos de hasta el 79%, mientras que, en presencia de otros alcoholes alifáticos, a medida que aumentaba el número de carbonos del alcohol fueron necesarios tiempos de reacción más altos y mayores cantidades de extracto enzimático. En el siguiente paso, los correspondientes derivados completamente desacetilados 7a-d se prepararon
mediante una metanolisis básica en presencia de Cs2CO3 como base débil con un rendimiento
Figura 32. Desacetilación regioselectiva del DHPG peracetilado 5 catalizado por el extracto enzimático de Bacillus sp. HR21-6, dando como resultado los diferentes derivados eterificados y monoacetilados 6a-d y sus correspondientes derivados desacetilados 7a-d
IV.6.2.3. Desacetilación del alcohol protocatecuíco peracetilado
En la desacetilación del alcohol protocatecuíco peracetilado 9 utilizando MeOH como disolvente (Figura 33), el grupo acetoxi de la posición bencílica fue sustituido por un grupo metoxi, originando el compuesto 10.
Figura 33. Deacetilación regioselectiva del alcohol protocatecuíco peracetilado 9 catalizada por el extracto enzimático de Bacillus sp. HR21-6, dando como resultado el éter metílico del alcohol protocatecuíco en la posición 2 (compuesto 10)
IV.6.3. Reacciones de acetilación de carbohidratos
El estudio de los distintos carbohidratos se abordó siguiendo las mismas pautas que para los compuestos fenólicos. De forma similar a lo que ocurría en la acetilación de polifenoles, para los compuestos 11, 12 y 16, incluso después de tiempos de reacción largos, no sólo se observó un bajo grado de conversión a los derivados acetilados, sino también una baja regioselectividad, traducida en una mezcla compleja de productos.
IV.6.4. Reacciones de desacetilación de carbohidratos peracetilados
Teniendo en cuenta la poca efectividad de las acetilaciones y el éxito de las desacetilaciones en los sustratos fenólicos, se decidió ensayar también las desacetilaciones en los derivados
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peracetilados de carbohidratos. Lo más destacable en las reacciones de desacetilación usando el sobrenadante de Bacillus sp. HR21-6 fue la perdida de simetría observada al usar como sustratos tanto la trehalosa y la sacarosa peracetiladas.
En el caso de la trehalosa peracetilada 13, la desacetilación solo se llevó a cabo en uno de los anillos de glucosa, total o parcialmente, dejando el segundo completamente acetilado, lo que dio lugar a una pérdida de la simetría en la molécula de la a,a-trehalosa en dos pasos, peracetilación y
desacetilación regioselectiva originando dos productos mayoritarios el 2,3,4,6-tetra-O-acetil- a,a-
trehalosa 14 y 2,3,4,6,6’-penta-O-acetil-a,a-trehalosa 15 (Figura 34).
Figura 34. O-Desacetilación regioselectiva de la trehalosa peracetilada 13 catalizada por el sobrenadante de Bacillus sp. HR21-6, dando como resultado 2,3,4,6-tetra-O-acetil- a,a-trehalosa 14 y el 2,3,4,6,6’-penta-O-acetil-a,a-trehalosa 15
La desacetilación regioselectiva de la sacarosa peracetilada 17 también originó la pérdida de simetría de la molécula dando los compuestos 2,3,4,6,6’-penta-O-acetilsacarosa 18 y 2,3,4,6,1’,6’- hexa-O-acetilsacarosa 19 que corresponden a la desacetilación del anillo de fructosa sin alterar el anillo de glucosa (Figura 35).
Figura 35. O-Desacetilación regioselectiva de la sacarosa peracetilada 17 catalizada por el sobrenadante de Bacillus sp. HR21-6, dando como resultado 2,3,4,6,6’-penta-O-acetilsacarosa 18 y 2,3,4,6,1’,6’-hexa-O-acetilsacarosa 19 17 sacarosa peracetilada 19 2,3,4,6,1’,6’-hexa-O- acetil sacarosa 18 2,3,4,6,6’-penta-O- acetil sacarosa 13 trehalosa peracetilada 15 2,3,4,6,6’-penta-O- acetil-a,a-trehalosa 14 R=2,3,4,6-tetra-O-acetil- a,a- trehalosa
IV.6.5. Reacciones de desacetilación de la oleuropeína
La oleuropeína es un secoiridoide aislado de las hojas y los frutos verdes de Olea europeae, que confiere el característico sabor amargo al aceite. Este compuesto es de gran interés debido entre otras, a sus propiedades antioxidantes, antiproliferativas y apoptóticas, o su efecto vasodilatador (Vanella et al. 2012; Goldsmith et al. 2018; Omar 2010a).
Teniendo en cuenta que las reacciones de acetilación con los diferentes extractos no fueron altamente regioselectivas tal y como se demostraron en los primeros ensayos se optó por ensayar directamente las reacciones de desacetilación de la oleuropeína peracetilada.
Por otra parte, debido al éxito obtenido en los resultados anteriores, tanto en sustratos fenólicos como en carbohidratos, y teniendo en cuenta la presencia de ambos compuestos en la estructura de la oleuropeína, se decidió probar la actividad del sobrenandante de Bacillus sp. HR21-6 sobre este sustrato para determinar la quimioselectividad de la reacción.
La desacetilación de la oleuropeína peracetilada 21 procedió en un tiempo de reacción muy corto y con poca selectividad. Se detectó una alta proporción del compuesto completamente desprotegido 20, junto a una pequeña proporción de los derivados tetraacetilados en la unidad de glucosa 22 ó 23, y del compuesto peracetilado de partida 21 (Figura 36).
Figura 36. O-Desacetilación regioselectiva de la oleuropeína peracetilada 21 utilizando el sobrenadante de
Bacillus sp. HR21-6, dando como resultado oleuropeina desacetilada y los derivados tetraacetilados en la unidad de glucosa 22 ó 23
IV.7. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LOS GENES RESPONSABLES DE LA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA DE Bacillus sp. HR21-6
Para este fin se llevaron a cabo diferentes estrategias: purificación a partir del propio organismo, identificación de las lipasas y esterasas en el genoma de la bacteria y análisis del secretoma. Los intentos de purificación de la proteína de interés a partir del sobrenadante del cultivo del propio organismo mediante columnas hidrofóbicas no condujeron a ningún resultado positivo, por lo que el estudio se centró en el análisis del secretoma de Bacillus sp. HR21-6.
IV.7.1. Secuenciación y análisis bioinformático del genoma de Bacillus sp. HR21-6
Con el objetivo de identificar el gen responsable de la actividad lipolítica en el sobrenadante de Bacillus sp. HR21-6, en un primer paso, se procedió a la secuenciación y ensamblaje del genoma de esta cepa con el objetivo de tener el catálogo completo de genes de dicha estirpe. Esto
21 R´= AcO 22 R1=H, R2= Ac 23 R1=OH, R2= Ac 20 R1=OH, R2= H
fue realizado por la Unidad de Genómica Funcional, Servicio de Biología, CITIUS. Para ello se utilizó una tecnología de secuenciación de última generación a través de un pirosecuenciador (Genome Sequencer FLX System 454, Roche). El ensamblaje de la secuencia se realizó usando el programa SOAP de novo, versión 1.05. Tras la optimización del ensamblaje mediante el emparejamiento de extremos y las relaciones de solapamiento para construir contigs, se obtuvo el ensamblaje final de la secuencia con un total de 63 contigs, un tamaño de 3.727.231 pbs y 41,26% de contenido G+C (Tabla 18). El genoma se anotó utilizando el servidor RAST, el cual realiza anotaciones rápidas utilizando tecnología de subsistemas y se determinó un porcentaje de similitud del 96,12% con Bacillus pumilus.
Tabla 18. Datos de secuenciación y filtración de datos del genoma de Bacillus HR21-6
Nombre de la muestra Tamaño medio (pbs) Total de bases secuenciadas tamaño de ensamblaje (pbs) Contigs Genes anotados Contenido G+C ADN Bacillus sp. HR21-6 407 84.233.404 3.727.231 63 3.961 41,26%
En el análisis del genoma de Bacillus sp. HR21-6 se determinó con una similitud elevada la presencia 5 lipasas y 27 esterasas.
IV.7.2. Análisis del secretoma de Bacillus sp. HR21-6
El análisis del secretoma de Bacillus sp. HR21-6 se inició con el aislamiento de dos fracciones extracelulares mediante centrifugación diferencial: la fracción extracelular soluble libre (FSEP;
Free Soluble Extracellular Fraction) y la fracción unida a las vesículas de membrana (OMV; Outer Membrane Vesicules). Para ello, esta cepa fue crecida en medio PYB a 37°C y se recogieron muestras a diferentes tiempos (24, 48 y 72 h) para su análisis.
El siguiente paso tras el aislamiento de las dos fracciones a diferentes tiempos fue comprobar la integridad de estas muestras mediante SDS-PAGE. Para ello se cargaron 2 μg de extracto de proteína total de cada muestra en geles de acrilamida al 10% y se tiñeron con nitrato de plata (Figura 37). Estos geles también fueron usados para la corrección de la cuantificación de proteínas mediante densitometría. Finalmente, tras comprobar un patrón proteico similar en todos los tiempos analizados, se decidió analizar sólo las fracciones obtenidas a las 48 h debido a que en ese punto se encontró muestras con una mayor actividad transesterificadora cuando se cuantificaba el ensayo colorimétrico usando como sustrato p-NP palmitato (Figura 37).
Para la identificación de las proteínas secretadas, se analizaron las muestras previamente digeridas con tripsina mediante QTRAP 5500, utilizando enfoques EM ER (Resolución Mejorada
de Masa). Mediante este procedimiento se identificaron un total de 28 proteínas en la fracción de
OMV y 48 en la fracción de FSEP (Tabla 19). De todas las proteínas identificadas sólo una mostraba homología con enzimas lipolíticas: una isoforma de la ramnogalacturonano acetilesterasa. Esta enzima estaba presente en las fracciones FSEP, pero no en las OMV.
Para confirmar este hallazgo, se realizó un análisis más exhaustivo de esta enzima mediante RMN (Resonancia Magnética Nuclear) en el que se analizaron dos péptidos (carga 2+ y 3+) con al menos tres transiciones cada uno. Mediante este análisis, se detectó que en las muestras FSEP, los picos detectados con la transición deseada para el péptido GATPLLLTPVGR eluyeron en los
mismos tiempos de retención. Estas transiciones magnéticas son originadas en el núcleo de la molécula y es específica para cada péptido. En el caso de las muestras de OMV, no se detectó ningún pico que presentase dicha transición a ese tiempo de retención (Figura 38).
Figura 37. Gel SDS-PAGE teñido con nitrato de plata, donde se muestra las proteínas presentes en las FSEP y OMV del sobrenadante de Bacillus sp. HR21-6 recogidas a diferentes tiempos. M. Marcador de pesos moleculares. PYB. Medio de cultivo utilizado para el crecimiento de Bacillus sp. HR21-6.
Tabla 19. Proteínas aisladas de las fracciones FSEP y OMV de Bacillus sp. HR21-6 y
número de péptidos encontrados en cada una de ellas con un índice de confianza del 95%
FSEP