Evaluation

El método más extendido para obtener recuentos de microorganismos en el suelo está basado en la siembra de diluciones de la muestra objeto de estudio, en medios de cultivo contenidos en placas Petri. Los microorganismos proliferan y dan lugar a colonias que pueden ser reconocidas individualmente. Aunque el método no esta exento de inconvenientes debido al desconocimiento de los requisitos nutritivos para gran parte de los microorganismos del suelo, sigue utilizándose en todo tipo de estudios (Wollun, 1982; Olsen & Bakken, 1987;

Parkinson & Coleman, 1991).

a) RECUENTO DE BACTERIAS VIABLES.

La estima de la población de bacterias viables se determinó mediante siembra y recuento en placa con un medio de cultivo inédito (SEX, Torrella, comunicación personal) que se caracteriza por ser bajo en compuestos carbonados. El medio se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 21 minutos. Las muestras de suelo se siembran en fresco inmediatamente después de haber sido tomadas.

Los recuentos se llevan a cabo pasados 5 días. Por regla general se consideran las diluciones en las que aparezca un número de colonias comprendido entre 50 y 200. Los resultados se expresan como la media de las tres réplicas referidas a gramos de suelo en peso seco. (Apéndice VII.2.10a).

b) RECUENTO DE HONGOS VIABLES.

La estima de propágulos fúngicos viables se determinó mediante siembra y recuento en placa con Agar Rosa de Bengala suplementado con cloranfenicol (0.05%).

Todo el proceso de siembras microbiológicas se realiza en cámara de flujo laminar.

(Apéndice VII.2.10b).

c) DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES.

Para la determinación de bacterias coliformes totales en el lodo se pesan 10 g de muestra en un vaso de precipitado y se añaden 90 mL de agua peptonada estéril. Se mantiene en agitación agitador magnético durante dos horas. Se toma 1 mL de la parte superior del contenido del vaso y se hace una batería de diluciones seriadas hasta 10-7. Se siembra en un medio específico para coliformes (Agar-VRB). Las placas se cultivan a 37 ºC en un incubador. (Apéndice VII.2.10c).

d) DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE SALMONELLA-SHIGELLA.

Este método es sólo cualitativo. Se basa en sembrar 1 mL del extracto de compost 10-1 en caldo de enriquecimiento Rapapport (Merck). Se cultiva 24 h a 37 ºC. Pasado este tiempo de cultivo, se siembra por estría con asa nicrom en placa con medio Salmonella-Shigella.

Las colonias de gérmenes Lactosa-negativos son incoloras y las de Lactosa-positivos son rosadas hasta rojas. Las colonias de microorganismos formadores de H2S presentan un

centro negro.

e) DETERMINACIÓN DE STREPTOCCOCOS.

De la dilución del extracto de compost elegida, se siembra por extensión 0.1 mL en placa con medio Slaznetz-Bartley agar (Oxoid). Se cultiva 24-48 h a 37 ºC y se cuenta el número de colonias.

f) DETERMINACIÓN DEL CARBONO DE LA BIOMASA.

En primer lugar hay que matizar que existen numerosísimas metodologías para cuantificar las actividades microbiológicas del suelo, tales como la medida de la respiración, contenido en ATP, liberación de calor, actividad deshidrogenasa, nitrificación, fijación de nitrógeno, etc. Para nuestro estudio hemos optado por determinar la biomasa de carbono, ya que es una medida muy representativa de la actividad de los microorganismos en el suelo, pues ellos utilizan los substratos como fuente de carbono y energía con la consiguiente formación de biomasa microbiana.

En segundo lugar matizar que las medidas de actividad microbiológica del suelo, en concreto de la biomasa de carbono, expresan únicamente la biomasa de microorganismos que habitan el suelo, ya que este tipo de medidas se llevan a cabo bajo condiciones de laboratorio sobre muestras de suelo homogéneas, tamizadas sin animales ni plantas visibles, los cuales son eliminados.

En contraste, el término actividad biológica implica las actividades metabólicas de todos los organismos del suelo, incluyendo microorganismos, animales y plantas, los cuales no son objeto del presente estudio.

El término biomasa microbiana edáfica se usa para describir la población microbiana del suelo. Cuando los suelos están cerca de unas condiciones estables con respecto al contenido total de materia orgánica, la biomasa microbiana representa cerca del 2-3 % del carbono orgánico total en suelos agrícolas, forestales y pastizales (Jenkinson & Ladd, 1981a;

Powlson & Jenkinson, 1981; Anderson & Domsch, 1989). En suelos donde la materia

orgánica varía debido a entradas tales como lodos de depuradora, la biomasa microbiana cambia más rápidamente que la cantidad total de carbono orgánico presente en el suelo

(Powlson et al., 1987). La biomasa microbiana es por tanto un temprano indicador de cambios

en las condiciones del suelo, mucho antes que los cambios en el carbono orgánico total.

Existen varios métodos para estimar la biomasa microbiana del suelo. Algunos se basan en el marcaje y conteo de células microbianas (Babiuk & Paul, 1970; Trolldenier,

1972; Paul & Johnson, 1977; Söderström, 1977; Torsvik & Goksoyr, 1978), en el uso de

parámetros fisiológicos tales como el ATP, la respiración y liberación de calor (Anderson &

Domsch, 1978; Sparling, 1981; Van der Werf & Verstraete, 1979; Sparling & West, 1988), o

en la aplicación de técnicas de fumigación (Shen et al., 1984; Jenkinson & Powlson, 1976a,

1976b, 1980; Brookes et al., 1985; Vance et al., 1987a, 1987b, 1987c; Joergensen et al, 1990).

Entre los diversos métodos disponibles, los más ampliamente utilizados son los métodos de fumigación con cloroformo: fumigación-incubación (Chaussod & Nicolardot,

1982; Jenkinson & Powlson, 1976b) y fumigación-extracción (Brookes et al., 1982, 1985; Saggar et al., 1981; Vance et al., 1987). Usualmente se utiliza el cloroformo como fumigante

porque rompe la mayoría de células de forma efectiva, además es fácil de eliminar del suelo. Actualmente el método de fumigación-extracción es el más empleado por su simplicidad y precisión. El método más usado para medir la biomasa de carbono se basa según lo descrito por Brookes et al., 1985.

Existen ventajas y desventajas con todos estos métodos e incluso limitaciones. Por ejemplo la técnica de fumigación-incubación presenta limitaciones con suelos ácidos con pH < 5 o con aquellos que han recibido recientes enmiendas orgánicas. El método de fumigación-extracción es más apropiado para suelos ácidos o aquellos que presentan substratos orgánicos.

En este estudio, la biomasa de carbono de los microorganismos edáficos se ha estudiado según el método de fumigación-extracción con cloroformo de Jenkinson y

Powlson (1976) adaptado por Brookes, 1985 y Vance et al., 1987. Este método también

ha sido propuesto por algunos autores como el método más adecuado para la medida de biomasa microbiana en suelos afectados por el fuego (Díaz-Raviña et al., 1992).

El método está basado en la fumigación del suelo con cloroformo y posterior extracción de la materia orgánica muerta con sulfato potásico y determinación del carbono de biomasa con el micrométodo espectrofotométrico del dicromato. El cloroformo rompe las membranas celulares de los microorganismos y de esta forma el material celular puede ser extraído del suelo. El método es detallado en el correspondiente apéndice (Apéndice

VII.2.10d).

III.5.13.- DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE AGUA