Example: A more complex analysis

Los AGI son componentes esenciales de la membrana celular. Asimismo son moléculas esenciales para la replicación de ADN, la diferenciación y la muerte celular. La perturbación en los niveles de los mismos puede ser letal para la célula a causa de la disrupción de la estructura de membrana 142. La fluidez de la misma es de importancia central para la función e integridad del sistema celular. Un parámetro crucial que determina la fluidez de la membrana es el balance entre los AGS y los AGI. Los organismos vivos, en particular los poiquilotermos, responden a una disminución en la temperatura aumentando la proporción de AGI. Este fenómeno ha sido designado con el nombre de adaptación homeoviscosa 1. Los AGI son sintetizados por las desaturasas que son un tipo especial de oxigenasas que pueden remover dos hidrógenos de una cadena hidrocarbonada y catalizar la formación de un doble enlace. En este capítulo se describió la biosíntesis de AGI en diferentes especies del género Bacillus cultivadas en condiciones definidas a 37°C y luego de un descenso en la temperatura de crecimiento a 25°C. A excepción de P. polymyxa

todos los bacilos estudiados responden a esta disminución en la temperatura de crecimiento, aumentando la proporción de AGI. Sin embargo, P. polymyxa, al igual que otras especies dentro de este género, aumenta la cantidad de AGR (de 25% a 38%) para contrarrestar el efecto del descenso térmico sobre la fluidez de la membrana.

Se realizó la caracterización funcional de las desaturasas presentes en B. cereus

ATCC 14579 y B. licheniformis ATCC 14580. Diferentes autores han mostrado que B. cereus sintetiza AGI con los dobles enlaces en diferentes posiciones 8,143,144. de Sarrau y colaboradores hallaron que B. cereus ATCC 14579 sintetiza no sólo los AGI ∆5 y ∆10

característicos de esta especie, sino que también encontraron AGI 16:1 ∆6 y 18:1 ∆9, cuando esta bacteria se cultiva en medios ricos 143. Haque y Rusell han estudiado muchas cepas diferentes de B. cereus aisladas de muestras de arroz y cultivadas en medios ricos en donde también encontraron AGI con insaturaciones ∆9 144. Durante este trabajo de Tesis se ha demostrado que en MM definido, en el cual no hay ninguna fuente externa de AG, B. cereus ATCC 14579 solamente produce AG monoinsaturados ∆5, ∆10 y diinsaturados ∆5,10; éstos últimos no habían sido detectados previamente por ninguno de los autores citados. Los AGI ∆6 y ∆9 hallados en otras investigaciones provienen del medio de cultivo y no son productos de las desaturasas de dichos microorganismos.

De la misma manera, Fulco ha detallado la presencia de AGI con los dobles enlaces en las posiciones ∆5, ∆8, ∆9 y ∆10 en diferentes cepas de B. licheniformis 5. En nuestro laboratorio se demostró que todas las cepas de B. licheniformis estudiadas sintetizan

Discusión I

88 únicamente AGI ∆5 en MM y que los demás isómeros hallados serían incorporados por las bacterias del medio de cultivo. Estos resultados fueron obtenidos en nuestro laboratorio al cultivar B. licheniformis en medios ricos, reafirmando así la hipótesis de trabajo que propone que sólo trabajando en medios mínimos y definidos es posible determinar la correcta composición de AG de las membranas de las bacterias (Mariana Alemany, Trabajo de Tesina). De allí el profundo interés en determinar las condiciones de crecimiento en MM para poder realizar una correcta identificación de los AG de las cepas en estudio.

También se demostró que tanto B. cereus como B. licheniformis responden a una disminución en la temperatura de crecimiento aumentando la proporción de AGI. B. licheniformis aumenta al doble la cantidad de AGI cuando se transfieren a 25°C los cultivos crecidos a 37°C, (de 3,2 % a 6 %, Tabla IX). En el caso de B. cereus los AGI aumentan de 27%, cuando se cultiva a 37°C, a 45% a 25°C y se ve un incremento especialmente de los AGI ∆5 de 2,7 a 8 %. Los diinsaturados aumentan 6 veces su cantidad de 2% a 37°C a 12% a 25°C, mientras que la proporción de AGI ∆10 prácticamente no sufre cambios (Tabla IX). Este hallazgo es llamativo ya que estas dos bacterias utilizarían principalmente la variación en la cantidad de AGI como mecanismo de adaptación a bajas temperaturas, mientras que la mayoría de los bacilos previamente descriptos en la bibliografía estimulan la biosíntesis de AGR de la serie anteiso para aumentar el desorden en la membrana 49 y mantener una correcta fluidez ante un descenso en la temperatura de crecimiento. B. cereus sólo aumenta de 5,4 a 7% la cantidad de AGR anteiso y B. licheniformis mantiene constante la proporción de los mismos alrededor de 18%. Esta observación también estaría influenciada por las condiciones de crecimiento de estas bacterias ya que cuando la determinación se hace en medio rico existen, además de AGI, precursores de los AGR que estarían influyendo sobre el porcentaje final de los mismos.

B. cereus posee dos genes anotados como putativas desaturasas, BC2983 y BC0400. La expresión heteróloga de dichos genes en una cepa B. subtilis que no sintetiza AGI, reveló que ambos codifican desaturasas activas que introducen el doble enlace en las posiciones ∆5 y ∆10 de las cadenas acilo de los AG esterificados a FL, respectivamente. En el genoma de B. licheniformis hay anotados dos genes como posibles desaturasas. La expresión de estos genes en la misma cepa de B. subtilis demostró que sólo el producto génico del gen BL02106 es activo como desaturasa con regioselectividad ∆5, mientras que el segundo gen no codificaría una desaturasa activa. De esta manera se renombraron las

Discusión I

89 desaturasas como DesA en el caso de la ∆5 desaturasa y DesB para la ∆10 desaturasa de B. cereus y DesL, para la única ∆5 desaturasa de B. licheniformis. El gen BL02692 se denominó desX por su alta homología con otras desaturasas, aún cuando no pudo determinarse qué actividad posee.

Cuando se expresaron los genes desA y desB de B. cereus en la cepa de B. subtilis

mutante en el gen des, se observó mayor acumulación de AGI, tanto para DesA como para DesB, cuando los cultivos a 37°C se transfirieron a menores temperaturas de crecimiento (Tabla XII). Esta observación contrasta con los resultados obtenidos al analizar el perfil lipídico de B. cereus (Tabla IX), en donde se observa que al disminuir la temperatura de crecimiento, el contenido del los AGI ∆10 permanece prácticamente constante. Este hecho estaría sugiriendo que, en B. cereus, los isómeros ∆10 pueden ser desaturados por DesA,

dando como resultado mayor cantidad de AG diinsaturados ∆5,10 a 25°C. La cantidad de isómeros ∆5 obtenidos al analizar tanto los AG de B. cereus (Tabla IX) como cuando se expresa DesA en B. subtilis (Tabla XII), aumentan cuando la temperatura de crecimiento disminuye. Estos resultados indican que la inducción a bajas temperaturas de la síntesis de AGI podría deberse a un aumento en la expresión o en la actividad desaturasa de ambas enzimas cuando se disminuye la temperatura de crecimiento.

B. licheniformis presenta dos genes anotados como putativas desaturasas. Sin embargo, con los experimentos llevados a cabo en este trabajo de Tesis, no se pudo hallar actividad desaturasa para el gen desX. Como se definió anteriormente, el término desaturasa incluye a todas las enzimas capaces de activar el oxígeno y usar este reactivo para una subsecuente modificación de un enlace C-H de un sustrato saturado o monoinsaturado, dando como productos no sólo dobles enlaces cis- o trans-, sino que también la inserción de grupos hidroxilo o epoxi, o incluso, como se ha postulado, la decarbonilación de grupos aldehído y deshidrogenación de ubiquinoles 42. Entonces, es posible que este gen esté codificando una enzima con una actividad diferente, cuyos productos finales de reacción enzimática no se pudieron detectar con las técnicas analíticas utilizadas al analizar los extractos lipídicos de las cepas que expresan este gen. Cabe destacar que los resultados obtenidos a partir de la expresión del gen desX son coherentes con los previamente desarrollados a partir de los cultivos de la cepa salvaje. En el perfil lipídico de la cepa B. licheniformis ATCC 14580 se encontraron únicamente AGI Δ5, los cuales serían producto de la desaturasa codificada en el gen desL, y no se evidenciaron otra clase de AGI. De esta manera podría suceder que la proteína codificada por el gen desX

Discusión I

90 utilizadas o bien que dicho gen, codifique para una desaturasa, en este caso podría ser una ∆5 desaturasa debido a los altos porcentajes de identidad y similitud con otras ∆5 desaturasas y que presente alguna mutación en algún dominio esencial para su actividad que hace que la misma no sea activa en las condiciones ensayadas.

Mediante la construcción de enzimas quiméricas, se pudo determinar, en nuestro laboratorio, que la fusión del dominio N-terminal del gen desA al gen desX, restauraba la actividad desaturasa del polipéptido codificado por este gen. La expresión de la proteína quimérica permitió obtener AGI con el doble enlace en la posición ∆5 (Diego Sastre, comunicación personal). Asimismo, el cambio puntual de la cisteína en la posición 40 de

desX por tirosina, que es el correspondiente AA presente en las desaturasas activas, restauró la actividad desaturasa de dicha enzima. Estos resultados indicarían que B. licheniformis, en algún momento durante la evolución, podría haber adquirido por transferencia horizontal de genes un segundo gen que codificaba una Δ5 desaturasa o bien podría haber duplicado el gen que ya poseía generando una secuencia paráloga en otra región de su genoma. Esta proteína paráloga tendría la misma o similar función, no obstante, se sabe que muchas veces no existe la misma fuerza selectiva original sobre la copia duplicada del gen, y ésta puede adquirir nuevas funciones por mutación y selección. En este caso, el producto del gen desX no debe haber tenido una función que le significara una ventaja al organismo y por lo tanto, dicho gen podría haber sufrido mutaciones que inactivaron definitivamente la actividad de su producto génico.

Debido a que las predicciones bioinformáticas realizadas con estas proteínas indican que las tres serían desaturasas de membrana, se estudió la naturaleza de los sustratos mediante experimentos in vivo utilizando una cepa de B. subtilis mutante en el gen plsC que presenta desacoplada la síntesis de AG con la de FL 130. Grau y de Mendoza habían demostrado que los sustratos de la desaturasa de B. subtilis son los AG unidos a los FL de la membrana 90. En este trabajo de Tesis se pudo determinar que las tres desaturasas en estudio efectivamente introducen los dobles enlaces en las cadenas acilo de los AG esterificados a los FL de la membrana. Por lo tanto, los datos obtenidos sugieren que DesA, DesB y DesL serían acil lípido desaturasas del tipo de desaturasas de membrana tilacoides de cianobacterias y cloroplastos de plantas 57. Si bien los experimentos llevados a cabo con las cepas mutantes en el gen plsC sugieren que los AG deben ser incorporados a los FL para poder ser desaturados, no se puede descartar la presencia, tanto en B. cereus

como en B. licheniformis de una vía que involucre la de-acetilación de los lípidos de membrana, la esterificación de los mismos a una coenzima, la desaturación de los

Discusión I

91 tioésteres formados y la re-acilación del AGI a los FL de la membrana. Para determinar si esta vía opera en estas bacterias se pueden realizar los mismos experimentos llevados a cabo con la cepa plsC pero en una cepa mutante en el gen panE, que codifica para la reductasa de ácido cetopantoico 145. Esta cepa es incapaz de sintetizar pantoato, precursor del pantotenato. El pantotenato se utiliza para la biosíntesis de CoA y ACP 146. Si en estas cepas todavía se observa acumulación de AGI se podría corroborar que los AG unidos a los FL de la membrana pueden ser desaturados sin necesidad de estar unidos previamente a alguna coenzima como CoA o ACP, como se había determinado previamente para la desaturasa de B. subtilis90 .

La reacción de desaturación consiste en la remoción de dos átomos de hidrógeno formando un doble enlace cis en la cadena hidrocarbonada de un AG, proceso para el cual las desaturasas utilizan equivalentes de reducción que obtienen de una cadena de transporte de electrones. En esta cadena participa una proteína transportadora de electrones que, en el caso de las desaturasas bacterianas, es la Fd. En nuestro laboratorio se había descripto por primera vez la participación de las Fld como proteínas transportadoras hacia una desaturasa cuando se analizó la síntesis de AGI en cepas de B. subtilis mutantes en dichas proteínas. Así se vio que la desaturasa de B. subtilis, Des, utiliza tanto Fd como Fld (YkuN e YkuP) en la cadena de transporte 94. Utilizando las mismas cepas de B. subtilis se estableció que DesA, DesB y DesL también pueden obtener los electrones requeridos para la catálisis de la Fd como de las Fld. Sin embargo, DesB no utilizaría la Fd tan eficiente como las Fld ya que en ausencia de Fd se produce sólo un ligero descenso de la síntesis de AGI. Si bien estos experimentos se llevaron a cabo en cepas de B. subtilis, mediante análisis in sílico, se pudieron identificar proteínas ortólogas en B. cereus y B. licheniformis con elevados porcentajes de identidad a la Fd y las Fld de B. subtilis. Estos datos, junto con los resultados de los experimentos detallados, sugieren que es altamente probable que Fd y Fld sean los dadores de electrones fisiológicos de las desaturasas de B. cereus y B. licheniformis.

CAPÍTULO II