Chapter 4. Unsupervised protein domain family identification in DF
4.1.2 Existing unsupervised family identification methods
Este método se denomina microdilución porque se utilizan pequeños volúmenes de caldo. La prueba se realiza en policubetas de plástico estériles de fondo cónico o redondo.
MATERIALES
Equipos
• Mechero tipo Bunsen
• Pipetas Pasteur plásticas descartables • 1 Reservorio con 12 compartimientos • 5 Reservorios sin compartimientos • Micropipeta multicanal para 12 y 8 puntas
• Microplacas de 96 pocillos fondo redondo esteriles
Soluciones, reactivos y medios de cultivo
• Solución fisiológica estéril, 3 ml en tubos 13X100
• Placas de agar Mueller Hinton (9 cm de diámetro, profundidad del agar de 4 mm ) • Placas de agar nutritivo (9 cm de diámetro)
• 12 Tubos 13x100mm con 4,5 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes • Tubo con 9,9 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes
• Estándar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
Preparación del caldo Mueller Hinton Comentarios teóricos
(1) Preparar el caldo M. Hinton a partir de la base deshidratada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Esterilizar en autoclave.
(2) El caldo que no se usa en el día puede mantenerse en refrigerador (2-8 ºC.).
(3) Controlar la esterilidad de una muestra representativa de cada lote incubando 24 horas o mas a 30-35 ºC. Luego descar esas muestras.
De los medios disponibles se considera al caldo M- Hinton el mejor para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que:
• Muestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad.
• Contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.
• Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas.
• Existen suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad realizadas en este medio.
No deberá observarse crecimiento bacterianas o micótico. Para verificar la esterilidad del medio, tome una muestra equivalente al 5-10% del total del lote producido. Ignorar cualquier contaminación esporádica; ej. una fracción de medio. Descartar el lote completo, si el nivel de contaminación es significativo (>10% del medio controlado).
pH: El caldo debe tener un pH 7,2 - 7,4 a
temperatura ambiente. Determinar el pH después de su preparación.
El pH para cada lote debe ser controlado cuando se prepara cada lote de medio. Si el pH es demasiado bajo, ciertas drogas (p ej. Aminoglucósidos, quinolonas y macrólidos) parecerán menos activas; mientras otras (p ej. tetraciclinas) parecerán tener mayor actividad. Si el pH es demasiado alto se podrían esperar los efectos opuestos. Ver Tabla 1
El método a utilizar dependerá del tipo de equipo disponible en cada laboratorio
Las correcciones necesarias serán realizadas por el agregado de NaOH 1M o HCl 1M
Si el pH está muy alejado del rango aceptable debe controlarse el procedimiento de la preparación del medio.
El agregado de largos volumenes de estas soluciones para correccion del pH puede alterar el contenido de sales del medio.
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar
cada lote de Mueller Hinton en su contenido de
Timidina se deberealizar la CIM de trimetoprima /
sulfametoxazol frente a Enterococcus faecalis ATCC® 29212 o ATCC® 33186. El punto final en estos casos corresponderá a la concentración en la que haya más del 80 % de reducción del crecimiento comparando con el control.
El medio se considera adecuado si el valor de la CIM es < 0.5/9.5 µg/ml.
En caso que se observe una CIM > 0.5/9.5 µg/ml podrá procederse al agregado de timidina fosforilasa o sangre lisada de caballo.
Los medios que contienen excesiva cantidad de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo así CIMes mas altas, lo cual puede dar como resultado un informe de falsa resistencia.
La timidina fosforilasa ya sea en su forma pura (aislada) o contenida en la sangre lisada de caballo inactivará los excesos de timidita presentes en el medio y la confiabilidad de las pruebas para sulfonamidas y trimetoprima frente a patógenos comunes, excepto para enterococos
Efectos por variación en la composición de cationes divalentes. Las pruebas realizadas con
cada lote de caldo M. Hinton deben estar de acuerdo con los límites de control para las correspondientes cepas ATCC (ver Control de Calidad). Los resultados de las pruebas con las cepas patrones deben ser cuidadosamente observados para detectar cualquier valor aberrante debido a la composición de cationes del medio de cultivo.
La variación en cationes divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarán los resultados con tetraciclina, colistín y aminoglucósidos frente a P.
aeruginosa. Un excesivo contenido de cationes
aumentará las CIMes, mientras que bajas concentraciones de cationes resultarán en CIMes menores a las esperadas. Un exceso de zinc podría aumentar las CIMes de los carbapenems
Los rangos aceptados son los siguientes (Método de absorción atómica o equivalente):
PROCEDIMIENTO
Día 1 Comentarios teóricos
a) Preparación de las soluciones de antibiótico (figura 11)
Se debe tener en cuenta que para la microdilucion, cada solución de antibiótico debe ser preparada 2 veces más concentrada que la deseada en el pocillo
Para pesar las drogas podrán utilizarse los conceptos y formulas descriptos para la dilución en agar con la salvedad que la solución de
antibiótico a preparar deberá ser de una concentración 2 veces superior a la del rango
superior deseado (2X). (Tabla 5)
Una vez preparada las diluciones del antibiótico, homegeinicelas perfectamente y con la misma pipeta llene el correspondiente compartimiento del reservorio de la pipeta multicanal comenzando por la solución mas diluida (Se deberán utilizar reservorios con 12 divisiones). Proceda de la misma manera para las otras 11 diluciones. (ver figura 11)
IMPORTANTE: Rotular los reservorios con el nombre del antibiótico que esta colocando y al menos la ubicación de la menor y mayor concentración del rango preparado.
Al finalizar todos los compartimientos (12) del reservorio de la pipeta multicanal quedarán llenos. Se utilizará un reservorio de 12 compartimientos por cada antibiótico a ensayar
b) Llenado de las policubetas con las diluciones del antibiótico (Figuras 11 y 12)
Este procedimiento se llevará a cabo mediante la utilización de la pipeta multicanal de doce puntas y el correspondiente reservorio.
De una vez se cargan las 12 diluciones del antibiótico en la línea de la policubeta correspondiente (ver figura 12). Rotular cada línea de las policubetas con el nombre del antibiótico que le colocó y las ubicaciones de la dilución menor y mayor del rango.
La solución de antibiótico se debe preparar de una concentración tal que duplique la deseada (2X). De esta forma, los pocillos serán cargados con 50 µl de la solución del antibiótico y 50 µl del inoculo.
Se deberá preparar una policubeta por cada cepa a ensayar. Cada una será idéntica con respecto a los antibióticos que contengan.
El inóculo estandarizado para el método de microdilución, se puede preparar permitiendo el crecimiento del microorganismo hasta la turbidez 0,5 de la escala de McFarland o bien resuspendiendo colonias directamente hasta alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusión por discos
Importante: agitar muy bien el estándar de turbidez antes de proceder a la comparación
Con pipeta de 0.1 o 0.2 ml, colocar 0.1 ml del
inóculo ajustado al 0.5 de Mc Farland (1 x 108
UFC/ml) en un tubo con 9.9 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes.
Control de calidad
Juntamente con las cepas incógnitas deberán ensayarse las cepas de referencia para el control de calidad del ensayo.
Con esto se logra una dilución 1/100 del inóculo
ajustado (1 x 106 UFC/ml). Cuando se colocan 50
µl de esta suspensión a cada pocillo se obtendrá una concentración final de bacterias de
aproximadamente 5 x 105 UFC/ml (inóculo
recomendado) al ser diluida al medio por el agregado de igual volumen de la dilución del antibiótico
d) Siembra de las policubetas de la microdilución (ver figura 13)
Tomar reservorios para pipetas multicanal sin compartimientos (o placas de petri) y volcar en cada uno la dilución 1/100 de cada una de las cepas preparadas en el punto 3.3
Una vez cargados los reservorios, tomar de a uno por vez y, con pipeta multicanal de 8 puntas, colocar 50 µl del inóculo en todos los pocillos de una de las policubetas preparadas
Importante: recordar que hay un pocillo control de caldo que sólo lleva 100 µl del caldo utilizado para preparar las diluciones del antibiótico
Repetir esta operación con todas las cepas a ensayar en sus respectivas policubetas
Importante: rotular cada policubeta con el nombre de la cepa que le colocó.
La aplicación del inóculo se debe realizar dentro de los 15 minutos posteriores a su ajuste
Cada policubeta debe incluir un pocillo de control de crecimiento (sin antibiótico), y un control negativo (caldo sin inocular):
Control de caldo: contendrá 100 µl de caldo Mueller Hinton ajustado con cationes.
Control de inòculo: contendrá 50 µl del inóculo de trabajo preparado en el punto 2.2.3. y 50 µl de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes.
e) Incubación
Apilar las policubetas terminadas y colocar en la de arriba un film plástico. Incubar 16-20 hs a 35º C en ambiente aeróbico.
Al finalizar la prueba, se debe sellar cada policubeta con tapa plástica, película plástica autoadhesiva o bolsa plástica para evitar la desecación. Esta cubierta plástica debe permitir el intercambio de temperatura
Para mantener una temperatura de incubación uniforme, se recomienda no apilar más de cuatro policubetas.
f) Lectura e interpretación
La CIM es la menor concentración de antibiótico capaz de inhibir completamente el desarrollo bacteriano en el pocillo, el punto final queda definido a simple vista por la falta de turbidez del caldo.
Cuando en una prueba de microdilución se obtiene un pocillo salteado, se debe leer la CIM más alta. Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final en estos casos corresponderá a la concentración en la que haya más del 80 % de reducción del crecimiento comparando con el control.
Los resultados de CIM obtenidos serán interpretados con la Tabla 2A y los organismos se informarán sensibles, intermedios o resistentes frente al antimicrobiano ensayado
Para determinar el punto final de desarrollo, debe compararse cada pocillo de la CIM con el pocillo control de crecimiento. El ensayo se considera válido si en el pocillo control de crecimiento se observa un botón de crecimiento o turbidez neta. Si apareciera más de un pocillo salteado con alguna droga, esta no se debería informar.
Este fenómeno ocurre por que pueden arrastrarse sustancias antagónicas de la síntesis del ácido fólico
g) Informe de los resultados
Figuras (*) Caldo Mueller Hinton ajustado en cationes SAT SAT ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml ____ µg/ml Figura 11
Reservorio para pipeta multicanal (12 divisiones)
Microdilución
Microdilución::
diluciones
dilucionesdel ATBdel ATB
2 ml Antibiótico:_________ ____ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
© Servicio ANTIMICROBIANOS – INEI - Dr. Carlos G. Malbrán
Microdilución
Microdilución: : ColocaciónColocación
del ATBdel ATB
(*) Se indica rango de TMP
Se deberá preparar una placa de microdilución por cada cepa a estudiar