Expected Yield of 180 bushels/acre

DESINFECCIÓN EN LA PLANTA A

El número de pulsotipos detectados en la Planta A al pasar del primer al segundo año del estudio se incrementó de 12 a 25, incluyendo un número elevado de pulsotipos esporádicos. Tras el segundo año, con la aplicación de diversas estrategias de control de

L. monocytogenes (apartado 6.1.1), el número de pulsotipos se redujo a 10 y descendió

el número de aislados de la mayoría de los pulsotipos (tabla 6).

Finalizados los tres años del estudio, y como resultado de los muestreos realizados en la misma planta durante el año siguiente, se identificaron 24 aislados adicionales de L.

monocytogenes, que se caracterizaron mediante PCR multiplex y PFGE (apartado 5.9).

El descenso en el aislamiento de L. monocytogenes durante ese cuarto año vino acompañado de la identificación de cuatro pulsotipos (S1, S4-1, S6 y S10-1), detectados previamente en la Planta A (tablas 6 y 10), donde tres de ellos (S1, S4-1 y S10-1) habían resultado persistentes, y dos de ellos (S1 y S4-1) se habían considerado

predominantes (apartado 6.1.4). Estos cuatro pulsotipos se consideraron

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Tabla 10. Pulsotipos de Listeria monocytogenes “supervivientes”.

Pulsotipo Nº de aislados

S1 13

S4-1 2

S6 1

S10-1 8

6.4.1. Características asociadas a la “supervivencia”

Mediante la Prueba exacta de Fisher se analizó la asociación de las características previamente estudiadas (tabla 8) con la “supervivencia” de los pulsotipos S1, S4-1, S6 y S10-1.

La Prueba exacta de Fisher no permitió asociar la “supervivencia” de un pulsotipo con algunas de las características analizadas (serotipo molecular, linaje o resistencia al cadmio). Tres de los pulsotipos (S1, S6 y S10-1) se habían caracterizado por la presencia de mutaciones asociadas a la atenuación de la virulencia, sin embargo, tampoco se pudo asociar la “supervivencia” de estos pulsotipos con la mayoría de las mutaciones identificadas en el gen inlA (P > 0.05), a excepción de la mutación tipo 5 (P = 0.04) (tabla 8). Respecto a prfA, S1 y S6 representaron una proporción significativa de los pulsotipos “supervivientes” (tabla 10, 50%; P = 0.01, Prueba exacta de Fisher). Con el fin de determinar si la “supervivencia” estaba relacionada con la resistencia a los desinfectantes del grupo de los amonios cuaternarios, se analizó la susceptibilidad a BAC de los 24 aislados detectados durante el cuarto año (apartado 5.13.1.2). Todos los

aislados de los pulsotipos S1, S6 y S10-1 resultaron BACR (MIC = 10-20 mg/l), pese a

que el único aislado de pulsotipo S6 detectado previamente (el primer año del estudio)

había resultado BACS (tabla 8). El pulsotipo S6, por tanto, incluía un aislado BACR y un

aislado BACS. Todos los aislados estudiados de los pulsotipos S1 y S10-1, y el aislado

del pulsotipo S6 detectado el cuarto año, por tanto, fueron las únicas cepas BACR

identificadas durante los cuatro años en la Planta A.

La resistencia a BAC fue una de las tres variables asociadas a la “supervivencia” de los pulsotipos (75%; P = 0.001, Prueba exacta de Fisher), junto con la mutación en prfA y la mutación tipo 5 en inlA previamente identificadas (apartado 6.3.1.2). Los tres

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pulsotipos “supervivientes” BACR

(S1, S6 y S10-1) pertenecían al serotipo molecular

1/2a, mientras que el otro pulsotipo “superviviente” BACS

(S4-1) pertenecía al serotipo molecular 1/2b.

Los desinfectantes de amonio cuaternario se emplearon en la Planta A con mayor frecuencia después del segundo año (comunicación personal de la empresa). Por tanto,

la selección de cepas BACR de L. monocytogenes de serotipo molecular 1/2a, podría

estar relacionada con ese aumento en el empleo de los desinfectantes de amonio cuaternario. Este supuesto parecía especialmente probable en el caso del pulsotipo S10- 1, cuya resistencia podría justificar el aumento de su número de aislados al pasar del segundo al tercer año, fechas en las que el número de aislados de la mayoría de los pulsotipos se redujo (tabla 6). Como conclusión, se puede decir que los valores de las MICs de BAC de S1 y S10-1 podrían estar relacionados con la supervivencia prolongada de estos dos pulsotipos.

6.4.2. Genotipos de resistencia a cloruro de benzalconio

La presencia en las cepas BACR de dos marcadores genéticos conocidos que confieren

resistencia a BAC en L. monocytogenes, el transposón Tn6188 (Müller et al. 2013) y el determinante genético de resistencia bcrABC (Elhanafi et al. 2010), se analizó mediante PCR (apartado 5.14).

El determinante genético bcrABC no se detectó en ninguna de las cepas BACR, y el

transposón Tn6188 se detectó sólo en una de ellas (S10-1). Para la detección del Tn6188 se emplearon cebadores específicos del gen de resistencia qacH y del gen radC en el que está insertado el transposón en las cepas descritas por Müller et al. (2013), lo que sugiere que en S10-1 el transposón Tn6188 estaría integrado también en el locus

radC. Estos autores (Müller et al. 2013) identificaron el transposón Tn6188 en 10 cepas

de L. monocytogenes, de un total de 91 cepas analizadas por PCR, mientras que el determinante genético bcrABC lo detectaron en cinco cepas del mismo grupo de 91 cepas. Las cepas que contenían el transposón Tn6188, aisladas de alimentos o del ambiente de la producción de alimentos, eran predominantemente de serotipo 1/2a, al igual que la cepa S10-1. Dutta et al. (2013), por el contario, al analizar un grupo de 116 cepas resistentes de diversos serotipos y orígenes (clínico, ambiental o alimentario), detectaron la presencia del determinante genético bcrABC en la mayoría de los aislados de L. monocytogenes, lo que sugiere una amplia distribución de bcrABC en las cepas

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6.4.3. Fenotipos de resistencia y susceptibilidad

Mediante la determinación de las MICs de diferentes compuestos antibacterianos, se analizó el fenotipo de resistencia de S1, S6 y S10-1, y la influencia de un inhibidor de las bombas de expulsión de tóxicos, la reserpina, sobre las MICs de BAC (apartado 5.13.1.2).

Además del fenotipo de resistencia de las cepas BACR “naturales” aisladas en la Planta

A, se analizó el fenotipo del mutante BACR obtenido en el laboratorio (“artificial”)

S2BAC, y se comparó con el fenotipo de susceptibilidad de su cepa parental S2-1. El

mutante S2BAC se obtuvo mediante la selección de colonias de la cepa S2-1 (tabla 6) en

agar Mueller Hinton suplementado con BAC, a partir de la placa con la mayor concentración de BAC que dio lugar a colonias que mostraron un incremento estable de la MIC tras el subcultivo sin BAC.

En los ensayos se incluyeron como controles la cepa de referencia L. monocytogenes

EGD-e (BACS), y las cepas BACR L. monocytogenes 4423 y L. monocytogenes CDL 69

(tabla 1).

En S1, en el aislado BACR de S6, y en el mutante S2BAC, se observó una

correspondencia entre la resistencia a BAC y la resistencia a bromuro de etidio (MIC de bromuro de etidio de 160 mg/l), así como una reducción del 50% en la MIC de BAC debida a la presencia de reserpina (tabla 11). Este fenotipo de resistencia múltiple (MDR) se confirmó con el incremento de las MICs de dos antibióticos no relacionados con el BAC (ciprofloxacino y gentamicina) y los detergentes catiónicos CTAB (un compuesto de amonio cuaternario, como el BAC) y clorhexidina. En la mayoría de los

casos, las MICs de los aislados BACR fueron tan sólo el doble de las de los aislados

BACS del mismo pulsotipo (tabla 11).

Por el contrario, en S10-1 no se observó correspondencia entre la resistencia a BAC y a bromuro de etidio (MIC de bromuro de etidio de 40 mg/l), ni reducción de la MIC de BAC en presencia de reserpina. En S10-1 las MICs de ciprofloxacino, gentamicina y clorhexidina resultaron similares a las de la cepa susceptible EGD-e, y la MIC de CTAB (20 mg/l) fue igual a la de BAC (tabla 11).

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Tabla 11. Patrones de resistencia y susceptibilidad de los cuatro pulsotipos

“supervivientes”.

a

Con S2BAC se obtuvieron idénticos resultados. b Con el aislado BACS del pulsotipo S6 y

con S2-1 (la cepa parental del mutante espontáneo S2BAC), se obtuvieron idénticos

resultados.

El fenotipo de resistencia mostrado por S1, el aislado BACR del pulsotipo S6 y el

mutante S2BAC, así como los resultados negativos de detección de los determinantes

qacH y bcrABC, apuntan a que las bombas de expulsión de tóxicos podrían ser

responsables, al menos en parte, de su resistencia. Este fenotipo podría asemejarse al de

otras cepas BACR descritas previamente, tanto mutantes resistentes obtenidos en el

laboratorio o “artificiales” (Romanova et al. 2006) similares a S2BAC

, como cepas resistentes “naturales” (Soumet et al. 2005) como S1.

6.5. INFLUENCIA DE LA PRESENCIA DE CLORURO DE BENZALCONIO