7. Topological sequence segments discriminate between class C GPCR
8.2. Feature selection used for the identification of subtype-discriminating
8.2.2. Experiments on the N-terminus
7.1.1. Extracción de ADN plasmídico de E. coli
Para la obtención de pequeñas cantidades de ADN (menos de 10 µg,
miniprep) se utilizaron dos métodos.
El primero (Stephen et al., 1990) es una variante de método de lisis alcalina de Sambrook et al. (1989). Se inocularon 3 ml de LB adecuadamente suplemen- tado con una colonia de la estirpe correspondiente de E. coli y se incubaron a 37°C durante 8-12 horas. Se centrifugó 1,5 ml del cultivo (13.000 rpm, la misma velocidad empleada en el resto de centrifugaciones del protocolo) durante 20 s, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 150 ml de una solución de Tris 50 mM pH 7.5, EDTA 10 mM y 10 mg/l ARNasa, previamente enfriada en hielo. Las células se lisaron mediante la adición de 150 ml de una solución de NaOH 0,2 M y 10 g/l SDS. Se agitó con suavidad hasta aclaramiento de la mezcla y se mantuvo en hielo. Finalmente se neutralizó la mezcla de lisis mediante adición de 150 ml de acetato potásico 1.32 M pH 4,8. Tras una nueva centrifugación de 5 min, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf. Para precipitar el ADN se añadieron 450 µl de isopropanol, se
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mezcló y se centrifugó 5 min. El precipitado de ADN se lavó por adición de 200 ml de etanol 70% y 5 min de centrifugación. Finalmente se eliminó el sobrenadante, se secó el precipitado y se resuspendió en 20 ml de tampón TE.
El segundo método consiste en el empleo de los materiales y soluciones proporcionados por el juego GFXTM Micro Plasmid Prep Kit (Amersham Biosciences)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para la obtención de cantidades elevadas de ADN plasmídico se utilizó el juego Midiprep Jetstar Plasmid MIDI Kit 50 2.0 (Genomed, Löhne, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.
7.1.2. Extracción de ADN genómico de F. fujikuroi
Para extraer ADN genómico del hongo se utilizó el juego Gen Elute Plant Genomic DNA miniprep (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante.
7.1.3. Extracción de ADN genómico de F. fujikuroi a pequeña escala
Para su uso como sustrato en reacciones de PCR, se hicieron extracciones de ADN genómico de F. fujikuroi a partir de pequeños fragmentos de micelio. En un tubo Eppendorf se mezclaron aproximadamente 1 mg de micelio, 300 mg de perlas de vidrio (0.5 µm), 200 µl de una solución de 20 g/l de tritón, 10 g/l de SDS, ClNa 100 mM, EDTA 1 mM y Tris HCl 10 mM pH 8, y 200 ml de fenol/cloroformo (1:1). La mezcla se agitó vigorosamente en Vortex durante 4 min, se centrifugó 5 min a 13.000 rpm y se transfirió la epifase a un tubo Eppendorf limpio. Posteriormente se añadió 1 ml de etanol 96%, se mezcló y se volvió a centrifugar. El precipitado se secó por vacío y se resuspendió en 400 µl de tampón TE. Para eliminar el ARN, se añadieron 3 ml de ARNasa (10 mg/ml), se incubó la mezcla 10-15 min a 37°C y se precipitó el ADN añadiendo 10 µl de acetato amónico 4 M y 1 ml de etanol 96%. La mezcla se centrifugó 5 min en una microcentrífuga a 13.000 rpm, se eliminó el sobrenadante, se secó el precipitado y se resuspendió en 50 µl de tampón TE. Con este tratamiento se obtuvieron típicamente muestras de ADN con una concentración de 20 ng/µl.7.1.4. Extracción de ARN total de F. fujikuroi
Las muestras de ARN se extrajeron con el juego Eukaryotic mini (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.
7.2. Cuantificación de la concentración de ácidos nucleicos
Para cuantificar las concentraciones de cebadores, plásmidos, ADN genómico y ARN total, se siguió a Ausubel et al. (1995). las concentraciones en mg/l de ADN y ARN se obtuvieron calculando la absorbencia a 260 nm en agua en cubetas de cuarzo de 1 cm de paso, utilizando los coeficientes de extinción 0,027 (ADN unicatenario), 0,02 (ADN bicatenario) y 0,025 (ARN unicatenario).
Cuando estuvo disponible, las medidas espectrofotométricas se hicieron con un equipo Nanodrop 3.0.1 (Coleman Technologies Inc., Orlando, Florida, EE.UU.).
Las concentraciones de fragmentos de ADN disueltos en pequeños volúmenes se estimaron mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Sambrook et al., 2001). La fluorescencia de las bandas de ADN, separadas en el gel, se comparó con la de marcadores de tamaño a concentraciones conocidas. Para este fin,
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se usaron habitualmente muestras del fago lambda digerido con HindIII.
7.3. Manipulación enzimática del ADN
Las enzimas empleadas para digerir muestras de ADN, rellenar los extremos de fragmentos lineales o ligarlos, se adquirieron a las compañías Amersham Biosciences, New England Biolabs (Ipswich, Massachussetts, EE.UU.), Fermentas GMBH (Leon-Rot, Alemania) o Roche (Basilea, Suiza).
7.3.1. Digestiones con enzimas de restricción
Las enzimas de restricción se usaron siguiendo las recomendaciones y tampones proporcionados por el propio fabricante, o bien siguiendo a Sambrook et al. (1989).
Las digestiones de ADN plasmídico se realizaron en volúmenes de 20 a 50 µl durante al menos dos horas a la temperatura recomendada.
Para las hibridaciones en Southern se digirieron muestras de 5-10 µg de ADN genómico con 20 unidades de enzima durante una noche en un volumen final de 450 µl. Antes de su separación en electroforesis, las muestras se precipitaron con 50 µl de acetato sódico 3 M pH 5.2 y 1 ml de etanol 96%. Posteriormente se centrifugaron a en una microcentrífuga a 13.000 rpm, se lavaron con 1 ml de etanol 70%, se secaron y se resuspendieron en los volúmenes adecuados de tampón TE.
7.3.2. Relleno de extremos de moléculas de ADN
A fin de obtener moléculas con extremos romos, los fragmentos de restricción con extremos 3´ unicatenarios salientes y los productos de las reacciones de PCR se trataron con el fragmento Klenow de la polimerasa del ADN (Roche). En el caso de los fragmentos con extremos 5´ unicatenarios salientes se utilizó la polimerasa del ADN de T4 (Roche). En ambos casos se siguieron las instrucciones del fabricante.
7.3.3. Ligaciones
Las ligaciones de fragmentos de ADN se realizaron en volúmenes de 10 µl utilizando 1 unidad de ligasa de T4 (Roche). Las incubaciones se llevaron a cabo durante una noche a 16°C.
7.4. Electroforesis de ácidos nucleicos
7.4.1. Electroforesis de ADN
Las electroforesis de ADN se hicieron en geles de agarosa de baja electroendo-ósmosis (Agarosa D1 baja EEO, Pronadisa, Madrid) a una concentración de 8 g/l o a otra concentración cuando los tamaños de los fragmentos relevantes a separar así lo requierieron. Para las electroforesis se empleó tampón TAE (Sambrook et al., 2001).
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Las electroforesis se llevaron a cabo en cubetas de las casas Lagoplast (Madrid) o Ecogen (Barcelona), conectadas a una fuente de alimentación Pharmacia, modelo LKB. Como marcadores del tamaño de los fragmentos de ADN se utilizó ADN del fago Lambda digerido con HindIII o marcadores comerciales (escalera de 1 Kb, Techline, Aberdeen, Washington, EE.UU.). Para las hibridaciones en Southern, en caso de detección no radiactiva se empleó el marcador Molecular III (Roche), que contiene fragmentos de tamaño conocido marcados con digoxigenina.
Las bandas de ADN se visualizaron con bromuro de etidio presente en el propio gel de agarosa o, en algunos casos, sumergiendo el gel en una solución de bromuro de etidio a una concentración de 5 mg/l. Los geles teñidos se expusieron a radiación ultravioleta en un transiluminador Fotodyne (Hartland, Wisconsin, EE.UU.) y se fotografiaron mediante un equipo de análisis de imagen ImageStore 5000, UVP. Los fragmentos destinados a la secuenciación o a la construcción de vectores de expresión se visualizaron con una fuente de mano de radiación ultravioleta de longitud de onda larga (312 nm).
7.4.2. Electroforesis de ARN
Para las electroforesis de ARN se emplearon cubetas, peines y bandejas tratadas previamente con NaOH 0,4 N durante 12 h y lavadas con agua tratada con DEPC. Se emplearon geles de 100 ml con 12 g/l de agarosa, incluyendo 10 ml de tampón MOPS 40 mM pH 7, acetato sódico 10 mM, EDTA 1 mM y 5,3 ml de formaldehído añadidos a 65°C, antes de la coagulación de la agarosa.
Las muestras a cargar en los geles contienen 15 µg de ARN en 10 µl de formamida, 3 µl de tampón MOPS, 3,5 µl de formaldehído 12,3 M y 4,5 µl de agua tratada con DEPC. Las muestras se calentaron a 65°C durante 15 min, se incubaron varios min en hielo y se mezclaron con 3 µl del tampón de carga usado habitualmente en las electroforesis de ADN previamente tratado con DEPC. Una vez cargadas, se separaron en el gel de electroforesis a 75 V.
7.5. Aislamiento de fragmentos de ADN de geles de agarosa
Los fragmentos de ADN de interés se visualizaron en el gel con la fuente de mano de radiación ultravioleta y se separaron cortando pequeños bloques de agarosa, de los cuales se extrajeron con dos métodos diferentes. El primero, basado en el uso de las columnas Wizard Minicolumns (Promega), consiste en meter el fragmento de agarosa en la columna y centrifugar durante 10 minutos a 13.000 rpm. El ADN, presente en el eluyente, se precipitó y se resuspendió en un volumen adecuado de TE.
El segundo método se basó en el empleo de columnas GFXTMPCR DNA, disponibles
en el juego Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences), utilizadas según las instrucciones del fabricante.