Un aspecto llamativo observado en el análisis resumido de las Figuras 41 a 45 y en la Figura 47 es el incremento de expresión de los genes de expansinas en los controles cuatro horas después de aplicado el tratamiento. Esto sugirió la hipótesis de que dicho incremento podría estar relacionado con el daño por el corte producido durante la cosecha del fruto, y dado que dicho daño estaría asociado a la producción de etileno (Liu y col., 1993; O'Donnell y col., 1996; Bouquin y col., 1997), se decidió analizar la posible relación entre esta hormona y la expresión de
FaEXP2 y de otros genes que codifican para enzimas presentes en la pared celular
(PGs y EG).
Figura 47: UV-C y expresión de genes de expansina: Análisis por Northern blot de la expresión
de los genes FaEXP2 (parte A), FaEXP4 (parte B) y FaEXP5 (parte C). Se usaron frutos de la variedad Aroma en estadio 50 % rojo: Controles (sin tratar) y Tratados con UV-C (4,1 kJ m-2), incubados a 20 ºC por 0 h (C0 y T0), 4 h (C4 y T4), 18 h (C18 y T18), 24 h (C24 y T24) y 48 h (C48 y T48). Se corrieron geles con ARN total de cada muestra y se transfirieron a membranas de nylon, que fueron hibridizadas con una sonda específica para cada gen de expansina o para el ARNr 18S. C0 C0 T0T0 C4C4 T4T4 C18C18 T18T18 C24C24 T24T24 C48C48 T48T48 FaEXP2 FaEXP2 ARNr ARNr18S18S C0 C0 T0T0 C4C4 T4T4 C18C18 T18T18 C24C24 T24T24 C48C48 T48T48 FaEXP2 FaEXP2 ARNr ARNr18S18S C0 C0 T0T0 C4C4 T4T4 C18C18 T18T18 C24C24 T24T24 C48C48 T48T48 FaEXP4 FaEXP4 ARNr ARNr18S18S C0 C0 T0T0 C4C4 T4T4 C18C18 T18T18 C24C24 T24T24 C48C48 T48T48 FaEXP4 FaEXP4 ARNr ARNr18S18S C0 C0 T0T0 C4C4 T4T4 C18C18 T18T18 C24C24 T24T24 C48C48 T48T48 FaEXP5 FaEXP5 ARNr ARNr18S18S C0 C0 T0T0 C4C4 T4T4 C18C18 T18T18 C24C24 T24T24 C48C48 T48T48 FaEXP5 FaEXP5 ARNr ARNr18S18S A
B
C
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Para analizar si los aumentos en la expresión de estos genes pocas horas después de la cosecha podrían estar influenciados por etileno, se cortaron frutos en estadio 75 % rojo de plantas de frutilla (Fragaria x ananassa cv. Toyonaka) y se trataron inmediatamente con 1-metilciclopropeno (1-MCP) durante 0 h, 2 h, 4 h y 8 h, manteniendo un grupo de frutos sin tratar como control.
Los resultados mostrados en la Figura 48 para FaEXP2 (Figura 48 A),
FaCEL1 (Figura 48 B) y poligalacturonasas (FaPGs, Figura 48 C) indican que en los
tres casos la expresión de los genes aumentó 4 h después de la cosecha en los frutos sin tratar con 1-MCP (ver muestras indicadas como C a las 4 h, comparado con los frutos C a las 0 h o 2 h). Este aumento de la expresión fue menos marcado a las 4 h en los frutos tratados con 1-MCP para los genes FaCEL1 y FaPGs (Figuras 48 B y C), mientras que para FaEXP2 el tratamiento con 1-MCP redujo los niveles de expresión luego de 8 h (Figura 48 A).
Figura 48: Tratamiento con 1-MCP y expresión de genes de pared. Se analizó la influencia del
etileno en el aumento de la expresión de genes de pared pocas horas después de la cosecha de frutos. Se cosecharon frutos de la variedad Toyonaka en estadio 75 % y se los trató inmediatamente con 1-MCP (T) o se dejaron sin tratar (C) durante 0 h, 2 h, 4 h y 8 h. Se extrajo ARN total de los frutos, se corrieron geles (mostrados como control de carga) y se transfirieron a membranas de nylon, que fueron hibridizadas con sondas específicas para los genes de expansina FaEXP2, endoglucanasa FaCEL1 y una sonda que reconoce poligalacturonasas. A: FaEXP2, B: FaCEL1, C: FaPGs.
C C CC TT CC TT CC TT FaPGs FaPGs ARN total ARN total 0 h 0 h 2 h2 h 4 h4 h 8 h8 h C C CC TT CC TT CC TT FaPGs FaPGs ARN total ARN total 0 h 0 h 2 h2 h 4 h4 h 8 h8 h C C CC TT CC TT CC TT FaEXP2 FaEXP2 ARN total ARN total 0 h 0 h 2 h2 h 4 h4 h 8 h8 h C C CC TT CC TT CC TT FaEXP2 FaEXP2 ARN total ARN total 0 h 0 h 2 h2 h 4 h4 h 8 h8 h C C CC TT CC TT CC TT FaCEL1 FaCEL1 ARN total ARN total 0 h 0 h 2 h2 h 4 h4 h 8 h8 h C C CC TT CC TT CC TT FaCEL1 FaCEL1 ARN total ARN total 0 h 0 h 2 h2 h 4 h4 h 8 h8 h A B C
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3. Discusión
El ablandamiento producido durante la maduración y postcosecha de frutos carnosos como la frutilla está relacionado con el desensamblaje de la pared celular y es llevado a cabo por diversas enzimas y proteínas presentes en la pared, incluyendo a las expansinas (Brummell y Harpster, 2001).
Entre los tratamientos físicos ensayados a escala de laboratorio para mejorar la postcosecha de frutilla, se encuentran los Tratamientos Térmicos de Alta Temperatura y la irradiación con UV-C. Entre otros efectos beneficiosos, se ha observado que ambos tipos de tratamientos contribuyen a retrasar el ablandamiento de frutillas (Civello y col., 1997; Baka y col., 1999; Pan y col., 2004; Vicente y col., 2005).
Este retraso en el ablandamiento ha sido observado en otros frutos, y se produciría a través de una disminución en la actividad de enzimas asociadas a la degradación de pared involucradas en este proceso (Paull y Chen, 2000). Se detectó una menor actividad glucanasa (Pressey, 1983), pectinesterasa (Ogura y col., 1976), endo-mananasa y galactosidasa (Sozzi y col., 1996) en tomate. En frutilla, tal disminución en la actividad de enzimas de pared celular fue observada en frutos que fueron tratados térmicamente tanto en estadios de maduración avanzados (Vicente y col., 2005) como en estadios tempranos (Martínez y Civello., en prensa). En relación a las expansinas de frutilla, hasta el momento solo se había analizado la expresión de FaEXP2 en frutos blancos tratados térmicamente y almacenados a 20 ºC, y se observó la disminución en la expresión del gen inmediatamente luego del tratamiento y en las siguientes 4 h (Martínez y Civello, en prensa).
La firmeza de los frutos tratados térmicamente o sin tratar disminuyó durante el almacenamiento a 20 ºC, desde valores cercanos a 2,5 N inmediatamente finalizado el tratamiento hasta aproximadamente 1,5 N luego de dos días (Figura 40). Una vez tratados los frutos, no se detectaron diferencias significativas entre Controles y Tratados. Sin embargo, a las 24 h la firmeza de los frutos Tratados fue mayor que la de los Controles, indicando un retraso en la tasa de ablandamiento. El efecto es temporario, ya que luego de 48 h la firmeza de ambos grupos de frutos es similar. Estos resultados están de acuerdo con resultados previos obtenidos en otras variedades de frutillas (Civello y col., 1997; Vicente y col., 2005).
En los resultados presentados en las Figuras 41 a 45 se muestra que los patrones de expresión de los genes de expansina en estudio son diferentes en frutos Controles y Tratados térmicamente. Se pueden distinguir tres comportamientos: los niveles de expresión fueron menores o iguales en frutos Tratados comparado con los Controles, como fue el caso de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP6; los niveles de expresión
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fueron mayores o iguales en frutos Tratados que en Controles, como resultó con la expresión de FaEXP5; o la expresión en frutos Tratados fue mayor, menor o igual que en los Controles, dependiendo del tiempo de incubación, como ocurrió con
FaEXP4.
Observando estos resultados en conjunto, podría interpretarse que la expresión menor en frutos tratados de los genes de FaEXP1 y FaEXP2 antes de las 24 h de incubación, estaría contribuyendo a la diferencia de firmeza observada entre los dos grupos de frutos en dicho periodo. Sin embargo, la expresión de los genes FaEXP4 y FaEXP5 es mayor a las 18 h en frutos tratados, y la de FaEXP6 fue levemente mayor en frutos tratados también a las 18 h de incubación. Probablemente, la contribución al ablandamiento por parte de FaEXP1 y FaEXP2 sea más importante que la de las demás expansinas, y una disminución en la expresión de estos genes en los frutos tratados en las horas iniciales posteriores al tratamiento podría contribuir al retraso del ablandamiento detectado durante las primeras 24 h de almacenamiento (Figura 40). La hipótesis actual es que las expansinas actúan directamente debilitando uniones tipo puente de hidrógeno de la pared celular y también de modo indirecto, facilitando el acceso del conjunto de enzimas hidrolíticas a la misma (Rose y col., 1997). De este modo, la menor acumulación de algunas expansinas y de una serie de enzimas relacionadas a la degradación de la pared estaría estrechamente relacionada con el retraso del ablandamiento del fruto tratado térmicamente.
Cuando se analizó la firmeza de frutos irradiados con UV-C, no se detectaron diferencias significativas entre Controles y Tratados inmediatamente después del tratamiento, pero los frutos Tratados resultaron más firmes luego de 2, 3 y hasta 4 días de almacenamiento después del tratamiento (Figura 46).
En este caso se seleccionaron los genes de expansina con expresión específica de fruto (FaEXP2 y FaEXP5) y uno de los genes que se expresan también en otras partes de la planta (FaEXP4) para analizar sus patrones de expresión en frutos irradiados con UV-C.
Como se muestra en la Figura 47, la expresión de las tres expansinas analizadas disminuyó inmediatamente luego del tratamiento o 4 h después de su aplicación, se produjo un pico de acumulación en frutos irradiados a las 24 h y luego se volvió a detectar una disminución en la expresión a las 48 h de incubación. Esto indicaría que la expresión de estos genes está influenciada por la irradiación con UV-C (Figura 46). Se observa en los patrones de expresión que después del notable aumento a las 24 h los niveles vuelven a ser menores en frutos Tratados, lo
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que correlaciona con las diferencias de firmeza encontradas a las 48 h. Además de la influencia de la irradiación UV-C sobre los genes de expansinas, se ha observado que este tratamiento también disminuye la expresión de FaPG1, FaPE1 y FaCel1, indicando que la posible disminución de la acción de estas y probablemente otras enzimas asociadas a la degradación de pared celular, podría estar provocando el retraso en la firmeza observado luego del tratamiento con UV-C (Pombo y col., enviado para publicación).
Es importante considerar que el análisis realizado en relación a la expresión de los genes de expansina luego de la aplicación del Tratamiento Térmico o de la irradiación con UV-C no tiene en cuenta las posibles regulaciones post- transcripcionales o post-traduccionales que puedan ocurrir en los productos de estos genes. En tal sentido, sería interesante evaluar el patrón de acumulación de proteínas en frutos Tratados con respecto a los Controles, a fin de analizar el comportamiento global de estas proteínas tras el Tratamiento Térmico o luego de irradiación con UV-C.
A partir de los resultados de los experimentos realizados para analizar el efecto del Tratamiento Térmico (Figuras 41 a 45), se puede observar que en los frutos Controles la expresión aumenta considerablemente entre las muestras C0 (inmediatamente después del tratamiento térmico, o sea entre 3-4 h después de la cosecha) y C4 (4 h después del tratamiento térmico, o sea entre 7-8 h después de la cosecha). Esto se detectó para la expresión de FaEXP1 (Figura 41), FaEXP2 (Figura 42), FaEXP4 (Figura 43), FaEXP6 (Figura 45) y un poco más levemente en el caso de
FaEXP5 (Figura 44). Un comportamiento similar se observó en los Controles
correspondientes a los experimentos de irradiación con UV-C (Figura 47). La expresión de los genes analizados en frutos no irradiados se incrementó en las muestras C0 (aproximadamente 2 h después de la cosecha) y C4 (aproximadamente 6 h después de la cosecha). Esto también se había observado respecto a la expresión de otros genes de pared celular analizados en frutos tratados térmicamente o con UV-C (Martínez y Civello, en prensa; Pombo y col., enviado para publicación).
Es conocido que las respuestas de las plantas ante los diversos daños a los que están sujetas es compleja (León y col., 2001; Cheong y col., 2002). En el caso de los daños mecánicos, la respuesta desencadenada involucra moléculas de señalización asociadas a estrés, entre las cuales se encuentra el etileno. Se han observado modificaciones en los niveles de esta hormona como consecuencia de
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dichos daños, y estos cambios influyen sobre la expresión de genes involucrados en distintos procesos celulares (O'Donnell y col., 1996).
El análisis de la expresión de los genes FaEXP2, FaPGs y FaCel1, mostrado en la Figura 48, indica que el aumento en la expresión de estos genes en los Controles entre 4 y 8 h después del corte es revertido en frutos tratados con 1-MCP, el cual inhibe competitivamente la unión del etileno al receptor. Esto sugiere que el incremento de la expresión de estos genes a las pocas horas de realizada la cosecha se produciría mediante un proceso que involucra al etileno. Sin embargo, el tratamiento con etileno sobre frutos en estadio VG o B no afectó la expresión del gen FaEXP2 (Figura 39 B, Capítulo III), mientras que la expresión de este gen sí fue afectada por el corte (Figura 48). La influencia del tratamiento con 1-MCP, inmediatamente después del corte, sobre la expresión de este gen podría interpretarse de varias maneras: se ha propuesto que en frutilla la sensibilidad al etileno podría ser diferente en distintos estadios de madurez (Tian y col., 2000), de modo que la expresión de FaEXP2 en frutillas de la variedad Toyonaka en estadio 75 % rojo, utilizadas en este caso, podría responder a la acción del etileno a diferencia de lo que ocurre en estadios iniciales de la maduración (VG o B) en frutillas de la variedad Camarosa, donde su expresión no fue afectada por etileno exógeno (Figura 39 B). Por otro lado, en la respuesta a daño existen evidencias de que un péptido denominado sistemina sería la señal móvil primaria involucrada en la activación de genes de defensa (Ryan, 2000), y que tendría un rol esencial en la respuesta activada por heridas, tanto local como sistémica, en plantas de tomate (McGurl, 1994). Se ha propuesto que el papel del etileno en la respuesta a daño mecánico sería potenciar la señalización activada por sistemina a través de la ruta del octadecanoide, mediante la cual se sintetiza ácido jasmónico (O'Donnell y col., 1996). De esta manera, la influencia del etileno sobre la expresión de FaEXP2 podría darse a través de sistemina y no por un efecto directo del etileno.
Teniendo en cuenta lo expuesto recientemente y las diferencias de expresión entre frutos Controles y Tratados térmicamente (Figuras 41 a 45) o con UV-C (Figura 47) pocas horas después del corte (C4 y T4), podría interpretarse que estos tratamientos, de alguna manera contrarrestan el aumento en la expresión de varios genes asociados a la degradación de pared provocado por el estrés producido por el corte. Esto podría contribuir, al menos en las primeras horas posteriores al tratamiento, al retraso en el ablandamiento observado en frutos tratados (Figuras 40 y 46). Un aspecto pendiente a evaluar es si el incremento de la expresión de este conjunto de genes de degradación de pared, y probablemente de otros, provocado por el corte del fruto tiene una incidencia relevante en la posterior vida poscosecha
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del mismo. De ser así, cobraría mayor importancia la aplicación de tratamientos físicos o químicos tempranos para demorar la expresión de estos genes, y de este modo extender la vida poscosecha del fruto.
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