PHASE II: RESULTS AND DISCUSSION
5.2 Data Analysis
5.2.3 Factor Analysis for School Librarians’ Readiness
Actualmente, a la hora de identificar y caracterizar proteínas de forma masiva la proteómica emplea de manera casi exclusiva la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS). De esta forma la mezcla compleja de proteínas (que puede llegar a englobar el proteoma completo de un tejido, célula u orgánulo) se digiere enzimáticamente, se separa mediante cromatografía líquida (LC), normalmente de alta presión o alta resolución (HPLC), y se analiza en un espectrómetro de masas acoplado en línea al cromatógrafo. Este abordaje permite la identificación masiva de proteínas de forma rápida, automática, reproducible y con una cobertura y un rango dinámico superiores a los de la antigua estrategia electroforética (Link et al, 1999; Washburn et al, 2001) (Figura 4).
Figura 4 | Identificación de proteínas mediante LC-MS. Los extractos proteicos se digieren dando lugar a péptidos (paso 1) que son separados mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (paso 2). A medida que los péptidos eluyen son ionizados en el espectrómetro de masas para obtener el espectro de masas de los denominados iones precursores (etapa MS1) (paso 3). Finalmente el espectrómetro de masas induce la
fragmentación por colisión de los iones precursores para obtener los correspondientes espectros de iones fragmento característicos de cada péptido (espectros de fragmentación, etapa MS2) (paso 4), cerrando un ciclo que se repite a
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espectro de fragmentación la secuencia de su péptido correspondiente (McHugh & Arthur, 2008) y se establece una tasa de error de acuerdo con diversos métodos probabilísticos (paso 5). Por último, durante la etapa de inferencia las secuencias peptídicas así identificadas son asignadas a las proteínas de las que provienen (paso 6). Dado que existen péptidos comunes a varias proteínas, este proceso de inferencia constituye un área activa de investigación (Nesvizhskii & Aebersold, 2005). Figura adaptada de (Ahrens et al, 2010).
La determinación precisa de los niveles de abundancia de las proteínas en los estudios de proteómica diferencial no es un asunto trivial. Las estrategias de cuantificación que prescinden de la utilización de marcajes (label free) para la comparación de dos o más muestras problema se basan en el simple recuento de péptidos de las proteínas identificadas; sin embargo, la fiabilidad de este tipo de aproximaciones ha sido puesta en entredicho, debido al carácter parcialmente estocástico del proceso de selección de iones en LC-MS (Figura 4, paso 4) (Li et al, 2012). Por ello se han desarrollado diversos tipos de marcajes, basados fundamentalmente en el uso de isótopos estables (SIL), que se utilizan habitualmente en proteómica de expresión diferencial: i) marcajes metabólicos, basados en la incorporación de isótopos de nitrógeno o aminoácidos marcados en células in vivo o en cultivo (SILAC) (Ong et al, 2002); ii) marcajes enzimáticos, como la introducción de átomos de 18O en el extremo carboxilo terminal de los péptidos producidos mediante digestión tríptica (Fenselau & Yao, 2007); y iii) marcaje mediante la utilización de reactivos químicos como ICAT (isotope-coded affinity tags), iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantification) y TMT (tandem mass tag) (Gygi et al, 1999; Ross et al, 2004; Thompson et al, 2003). En el presente trabajo de Tesis Doctoral se ha utilizado el marcaje iTRAQ para los estudios de proteómica cuantitativa.
3.1.1. La metodología iTRAQ
Tal como se introdujo en líneas anteriores, el marcaje iTRAQ es un tipo de marcaje químico basado en etiquetas isobáricas que reaccionan con el extremo amino y las lisinas de los péptidos. Los péptidos provenientes de cada condición a comparar (hasta un máximo de ocho) son marcados con una etiqueta específica que permite su cuantificación relativa de forma simultánea (multiplexing) (Nikolov et al, 2012; Ross et al, 2004). Tras el marcaje isobárico diferencial se mezclan las distintas muestras y se procede a su análisis masivo por MS. El marcaje isobárico determina que una misma secuencia peptídica marcada con distintas etiquetas (una por condición) dé lugar a un único precursor en el espectro de masas MS1 (Figura 4, paso 3) cuya intensidad es la suma de las intensidades de cada uno de los componentes isobáricos. La fragmentación (MS2) del precursor libera iones reporteros monocargados (a m/z 114, 115, 116 y 117, en el caso del iTRAQ 4-plex) cuya intensidad es proporcional a la abundancia del péptido en cada una de las condiciones objeto de estudio, permitiendo así su cuantificación relativa (Figura 5).
Entre las ventajas que ofrece iTRAQ frente a otras técnicas SIL destaca que la cuantificación se lleve a cabo en el espectro de fragmentación, lo que le proporciona una gran especificidad. Además, la intensidad del precursor es la suma de las intensidades de cada uno de sus componentes isotópicos
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provenientes de las distintas condiciones a comparar, lo cual redunda en una mayor sensibilidad y permite la utilización de cantidades menores de proteínas (Evans et al, 2012), algo especialmente deseable en el caso de muestras biológicas.
Figura 5 | Bases de la metodología iTRAQ. (A) El reactivo iTRAQ consta de un extremo reactivo que reacciona con el extremo amino y los residuos de lisina de los péptidos, un reportero de masa variable y un balanceador que permite que la masa de la etiqueta incorporada a los péptidos sea idéntica para una misma secuencia peptídica proveniente de las distintas condiciones consideradas. De esta forma esos péptidos isobáricos coeluirán en un único tiempo cromatográfico. (B) En la fragmentación del precursor único en el espectrómetro de masas, los reporteros iTRAQ se liberan dando lugar a señales a m/z 114, 115, 116 y 117, en el caso del marcaje iTRAQ 4-plex, cuya intensidad refleja la abundancia relativa del correspondiente péptido en cada condición (a, b, c, d). La identificación de la secuencia peptídica se lleva a cabo sobre la base del espectro de fragmentación.
En cuanto a sus limitaciones, el marcaje iTRAQ requiere que las etapas de marcaje y de fragmentación se produzcan eficazmente para asegurar la fiabilidad de los resultados (Nikolov et al, 2012). A estas limitaciones se suma la carencia de modelos estadísticos adecuados capaces de evaluar y paliar en la medida de lo posible la variabilidad inherente al proceso (Luo & Zhao, 2012). Para subsanar estos defectos, en la presente Tesis Doctoral se aplicó el modelo estadístico WSPP (Weighted Spectrum,
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3.1.2. Proteómica redox y análisis sistemático de modificaciones oxidativas en residuos de Cys Aunque los estudios proteómicos construyen el camino entre los estudios genómicos y funcionales, el estudio sistemático de PTMs supone un gran avance en relación a los mecanismos moleculares de regulación. El desarrollo de técnicas para el marcaje isotópico de péptidos y la purificación selectiva de los péptidos modificados han permitido aplicar estas metodologías al análisis sistemático de PTMs haciéndolas estandarizables y asequibles (Choudhary et al, 2009; Zhou et al, 2001). El rango de PTMs que pueden estudiarse es muy amplio incluyendo, entre otras, acetilaciones, fosforilaciones, ubiquitinaciones, metilaciones y oxidaciones (Altelaar et al, 2013). Sin embargo, en los últimos años ha destacado el análisis de modificaciones oxidativas, lo que ha dado lugar a lo que se conoce como proteómica redox (Bachi et al, 2013; Ckless, 2014; Lennicke et al, 2016).
En general, el papel de las modificaciones oxidativas en condiciones fisiopatológicas sigue siendo bastante desconocido. Frecuentemente se asocian con estrés oxidativo derivado de ROS y especies reactivas del nitrógeno (RNS), si bien es cierto que dichas modificaciones forman parte de importantes mecanismos regulatorios dentro de la célula (Holmstrom & Finkel, 2014). La naturaleza de las modificaciones oxidativas puede ser reversible (como las S-nitrosilaciones, la formación de puentes disulfuro o las sulfenilaciones) o irreversible (como las carbonilaciones, las sulfonilaciones o sulfinilaciones, entre otras). Las modificaciones reversibles suelen asociarse a fenómenos de señalización redox o daño oxidativo leve (Go et al, 2015) mientras que las modificaciones irreversibles se asocian a un daño oxidativo más severo (Lennicke et al, 2016).
Aunque los aminoácidos que pueden sufrir modificaciones oxidativas son varios, se considera que el aminoácido más sensible a ellas es la cisteína (Cys) debido a su naturaleza química y el rango de modificaciones que puede sufrir en su grupo tiol (Salsbury et al, 2008). Los residuos de Cys, altamente reactivos y conservados, están a menudo presentes en dominios catalíticos de proteínas (Go et al, 2015), por lo que se los considera auténticos “interruptores” moleculares de la actividad celular (Schafer & Buettner, 2001). Se han descrito diversas implicaciones para las modificaciones oxidativas en Cys, entre las que destacan el aumento o disminución de la función, la alteración de la localización subcelular de las proteínas afectadas, la modificación de las interacciones proteína-proteína y la regulación de la estabilidad (Holmstrom & Finkel, 2014). En los últimos años la importancia de estas modificaciones ha tomado una especial relevancia en el estudio de la mitocondria (Bak & Weerapana, 2015), orgánulo que es considerado el principal contribuyente a la concentración de ROS intracelular (Kowaltowski et al, 2009).
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