Todas las inmunocitoquímicas se realizaron sobre cortes de diferente grosor, depositados sobre portaobjetos multipocillo previamente recubiertos con APTES para asegurar la adhesión de los cortes durante todo el experimento (Apartado 3.3.2)
3.5. Esquema general de la reacción inmunocitoquímica
3.4.1.1Inmunomarcado con oro coloidal y amplificación con plata
Para este tipo de inmunocitoquímicas se emplearon los anticuerpos anti-JIM5 y anti-JIM7 frente a pectinas no esterificadas y pectinas altamente esterificadas respectivamente (Tabla 7).
Anticuerpo Tipo Características
inmunológicas Antígeno Dilución Referencia
JIM5 Rata Monoclonal Pectinas
esterificadas Puro Knox J.P, 1997
JIM7 Rata Monoclonal Pectinas no esterificadas
Puro Knox J.P, 1997
Tabla 7. Condiciones de los Anticuerpos primarios para M.O.
Las muestras se lavaron tres veces con PBS, durante 5 min cada vez y a continuación se incubaron con albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % (p/v) durante 5 min, para bloquear las uniones inespecíficas del anticuerpo. Seguidamente, se incubaron en una cámara húmeda, durante 60 min con los anticuerpos primarios (Tabla 7). Tras tres lavados con BSA al 1%, de 5 min cada uno, los cortes se incubaron con el anticuerpo secundario Anti-Rata- IgG marcado
con oro de 10 nm y diluido 1/25 en PBS, durante 45 min en cámara húmeda. Tras realizar tres lavados de 5 min con PBS, se procedió al revelado de la reacción. La amplificación de la señal se llevó a cabo con un kit de amplificación con plata (British BioCell, Cardiff, UK) incubando los cortes con una mezcla a partes iguales de los dos componentes del kit. La reacción se siguió en el microscopio óptico bajo campo claro y se paró con agua en el momento de observar la formación de un precipitado denso sobre el tejido.
Finalmente, una vez que los cortes estuvieron completamente secos, se procedió al montaje con Eukitt, de forma permanente.
Los controles se realizaron bajo las mismas condiciones, sustituyendo el primer anticuerpo por PBS.
Las preparaciones se observaron en un microscopio Zeiss Axioplan con objetivos de contraste de fase y campo claro.
3.4.1.2Inmunofluorescencia.
Las inmunofluorescencias se realizaron sobre secciones obtenidas por los diferentes métodos de corte explicados en los apartados anteriores. Según los requerimientos de cada momento.
Se empleó el mismo protocolo general en todos los casos, incluyendo modificaciones específicas según el tipo de corte.
Los anticuerpos primarios empleados se muestran en la tabla 8.
Anticuerpo Tipo Características
inmunológicas Antígeno Dilución Referencia Anti-RNA ratón Monoclonal RNA total celular puro Eilat D et al.
1991
Anti-5mdC ratón Monoclonal 5mdC 1/50 Eurogentec
JIM 5 rata Monoclonal Pectinas no
esterificadas puro
Knox J.P, 1997
JIM7 rata Monoclonal Pectinas
esterificadas puro
Knox J.P, 1997
Anti-
caspasa 3 conejo Monoclonal Caspasa 3 activa 1/5 Cell signalling
Los anticuerpos secundarios empleados en todos los casos fueron Alexa 488 (Invitrogen) frente a diferentes especies, según la naturaleza de los anticuerpos primarios. Las condiciones de incubación de los anticuerpos secundarios se reflejan en la tabla 9.
Anticuerpo Dilución Tiempo Temperatura Referencia
Alexa 488 Anti-ratón 1/25 1h Ta Invitrogen
Alexa 488 Anti-rata 1/25 1h Ta Invitrogen
Alexa 488 Anti-conejo 1/25 1h Ta Invitrogen
Tabla 9. Anticuerpos secundarios empleados en inmunofluorescencias para MO.
1. Inmunofluorescencia sobre cortes semifinos de Historesin:
Las muestras se lavaron tres veces con PBS, durante 5 min cada vez y a continuación se incubaron con albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % (p/v) en tampón PBS, durante 5 min, para bloquear las uniones inespecíficas del anticuerpo. Seguidamente, se incubaron en una cámara húmeda, durante 60 min con los anticuerpos primarios (Tabla 8). Tras tres lavados con BSA al 1%, de 5 min cada uno, los cortes se incubaron durante 45 min, con el anticuerpo secundario apropiado, en cada caso, protegidos de la luz. Tras realizar tres lavados de 5 min con PBS, los cortes se incubaron con la solución de trabajo de DAPI durante 5 min. Finalmente, se lavaron 3 veces de 5 min con agua destilada y se montó con “Mowiol®4-88” para su observación de en el Microscopio Laser Confocal espectral (CLSM) Leica TCS SP5.
Todo el proceso se realizó a TA. Las condiciones de incubación de los anticuerpos primarios se reflejan en la tabla 8.
2. Inmunofluorescencia sobre criocortes semifinos
La inmunofluorescencia se realizó sobre criocortes semifinos de 1 µm almacenados a -20ºC adheridos a portaobjetos recubiertos con APTES (Apartado
En este caso, los portaobjetos con las muestras se sacaron unos minutos antes de comenzar el proceso para que se atemperasen.
A continuación, se lavaron intensamente con agua destilada, para eliminar completamente los restos de sacarosa 2,3 M.
La reacción de inmunofluorescencia se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito para cortes semifinos de Historesin, sustituyendo la solución de bloqueo convencional, BSA al 5%, por un agente bloqueante más poderoso como es el suero fetal bovino (FCS) al 10% (p/v) en tampón PBS. Así mismo, las diluciones de los anticuerpos primarios se realizaron en FCS al 5%, en vez de BSA al 1%.
3. Inmunofluorescencia sobre cortes de vibratomo y cortes de criostato
Los cortes obtenidos en vibratomo y criostato son de 30-50 µm de grosor, por lo que se permeabilizaron para facilitar la penetración del anticuerpo.
La permeabilización consistió en someter a la muestra a un proceso de deshidratación-rehidratación, seguido de incubaciones con enzimas de digestión de determinados componentes de la pared celular tal. La deshidratación se consiguió mediante la incubación de 5 min en soluciones de metanol de concentración creciente (30, 50, 70 y 100%) (v/v) preparadas en agua destilada. A continuación, se procedió a la rehidratación de la muestra mediante incubaciones de 5min en soluciones de metanol de concentración decreciente (100, 70, 50, 30%) Tras lavar con PBS durante 5 min, las muestras se incubaron con celulasa al 2% (p/v) en PBS, durante 40-60 min en cámara húmeda, para evitar su evaporación.
Transcurrido este tiempo, se realizaron tres lavados con PBS de 5 min cada uno y se continuó con el protocolo de la inmunocitoquímica convencional (Apartado 3.4.1).
Es importante destacar que todas las incubaciones con anticuerpos se realizaron en cámara húmeda para evitar su evaporación.
A partir de la incubación con el anticuerpo secundario, los siguientes pasos transcurrieron en oscuridad.
Los controles se realizaron bajo las mismas condiciones, sustituyendo el anticuerpo primario por PBS, excepto en el caso de lo anticuerpos anti-5mdC y anti-caspasa 3, en los cuales, los controles negativos se realizaron empleando un péptido bloqueante del anticuerpo.
Finalmente, las preparaciones se montaron de forma semipermanente con “Mowiol®4-88”, para su observación de en el Microscopio Laser Confocal espectral (CLSM) Leica TCS SP5.
3.4.2Inmunomarcado con oro coloidal e hibridación in situ para