Cromatografía líquida de alta eficacia asociada a detección fluorimétrica
Dentro de los métodos químicos de detección de toxinas, la cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a la detección fluorimétrica (HPLC-FD) ha sido ampliamente utilizada durante muchos años para la determinación de los diferentes grupos de toxinas lipofílicas. Debido a la falta de cromóforos en la molécula, la mayor parte de los métodos se han basado en la derivatización química precolumna de las toxinas por reacción de los extractos con reactivos fluorescentes que, tras su posterior separación en la columna cromatográfica, son detectados como derivados fluorescentes de las toxinas.
Se han descrito un amplio número de reactivos fluoróforos que pueden reaccionar con el grupo carboxilo del ácido okadaico y el de sus análogos (DTX1, DTX2). Entre ellos, el 9- antril-diazometano (ADAM) (Lee et al., 1987), ha sido el más ampliamente utilizado debido a su selectividad y sensibilidad. El límite de cuantificación está alrededor de 100 ng g-1 de tejido o 10-20 ng g-1 en el caso de que se utilice la glándula digestiva como muestra para el análisis. Este método se aplicó con éxito en la determinación de AO y DTXs en mejillones, arrastres fitoplanctónicos y en células aisladas en varias contribuciones de esta tesis doctoral
Los derivados acilados de este grupo de toxinas necesitan de una hidrólisis química o enzimática de los grupos ésteres previa a su detección fluorimétrica. En el caso de las toxinas tipo “DTX3” la dificultad de separación cromatográfica en el método de Lee (1987) es consecuencia de sus elevados pesos moleculares y alta lipofilicidad, por lo que su presencia
solo puede ser investigada mediante su conversión previa a la toxina de origen mediante la hidrólisis alcalina de los extractos. Este procedimiento fue utilizado en uno de los trabajos que forman parte de esta tesis doctoral (Fernández et al., 1996) y permitió la primera detección de este tipo de derivados acilados del AO en mejillones de las Rías Gallegas así como la posterior investigación, en otra de las contribuciones de esta tesis doctoral, de la presencia de derivados acilados del AO y DTX2 en mejillones, posibilitando además el estudio de la dinámica de formación y eliminación de estas toxinas (Fernández et al., 1998).
En el caso de las toxinas DSP esteríficadas en el grupo carboxilo, tales como los diol ésteres o compuestos del tipo DTX4 y DTX5, éstas resultan opacas en la detección directa al no estar el grupo carboxilo, necesario para la derivatización fluorimétrica, libre. Por este motivo se requiere también una hidrólisis previa ya sea de tipo químico como la anteriormente mencionada o enzimática. Quilliam et al. (1996) han mostrado que cuando las células se rompen durante extracciones simples con metanol acuoso, tiene lugar una hidrólisis rápida catalizada enzimáticamente de la DTX4 a los diol ésteres que, a su vez son más lentamente hidrolizados a AO, dando lugar a resultados erráticos en la determinación de las concentraciones de toxinas. Para evitar esto, los autores proponen realizar un procedimiento de extracción con una ebullición previa que restringe la hidrólisis enzimática y permite la detección del contenido original celular de AO, DTX1 y DTX2. Los mismos autores han propuesto un método de extracción mediante congelación-descongelación-hidrólisis que promueve la conversion de las toxinas esterificadas a AO, DTX1 o DTX2 y permite la valoración de manera indirecta de la contribucion de dichos derivados al contenido de toxinas de tipo DSP. Estos procedimientos fueron aplicados con éxito en el estudio de los perfiles de toxinas de diferentes cepas de P. lima (Bravo et al., 2001) y de diferentes especies de
Dinophysis (Fernández et al; 2001, 2003a, 2006) como se muestra en el capítulo I.
El método de ADAM ha sido ampliamente investigado y con el tiempo se han introducido una serie de modificaciones destinadas a mejorar la robustez del mismo (Quilliam
et al., 1995; 1998) y, aunque la inestabilidad del reactivo de ADAM y la posibilidad de
pérdidas de toxinas durante los procesos de purificación sólido-líquido de las muestras han sido descritos como los puntos débiles de este procedimiento, un estudio en profundidad de los métodos disponibles de HPLC-FD mostró que era el más robusto (Ramstad et al., 2001a, b). Entre los reactivos alternativos investigados en el estudio comparativo se encuentran el 1- Bromoacetilpireno (BAP) (Dickey et al., 1993) (que mostró una mayor estabilidad pero menor sensibilidad y selectividad); varios derivados de cumarina (Shen et al., 1991, Luckas et
(AE-Otf) (Akasaka et al., 1996b) (también utilizado para la determinación de “DTX3” (Akasaka et al., 1996 a) y la luminarina-3 (James et al., 1998b).
En lo que respecta a las pectenotoxinas, aquellas que poseen un grupo carboxílico libre tales como la PTX6 y la PTX7 pueden ser determinadas utilizando ADAM (Yasumoto et al., 1995) en tanto que para la determinación de PTX1 y PTX4 se ha propuesto el uso de antrilcarbocianida (Lee et al., 1989b). Para las yesotoxinas se ha desarrollado un procedimiento alternativo que utiliza el reactivo dienófilo DMEQ-TAD (4-[2-(6,7-dimetoxi- 4-metil-3-oxo-3,4-dihidroquinoxalinil) etil]-1, 2, 4-triazolino-3,5-diona) como reactivo fluoróforo (Yasumoto y Takizawa, 1997). Este mismo reactivo fue también propuesto para la determinación de PTX2 (Sasaki et al., 1999).
Cromatografía líquida de alta eficacia asociada a espectrometría de masas
El desarrollo y la implementación de la cromatografía líquida de alta eficacia acoplada con la espectrometría de masas (HPLC-MS y HPLC-MS/MS) para la detección y determinación de toxinas marinas en fitoplancton y moluscos ha sido crucial en el avance del conocimiento en este campo. Además de su elevada sensibilidad, selectividad y especificidad, esta técnica permite evadir los laboriosos procesos de derivatización asociados a los métodos de HPLC-FD, al tiempo que proporciona una información estructural muy valiosa para la identificación de las toxinas conocidas o para la detección de toxinas desconocidas. En efecto, aunque al igual que en los otros métodos se requiere la disponibilidad de estándares a efectos de calibración y cuantificación, la cromatografía líquida asociada a la espectrometría de masas nos proporciona una información estructural relevante que permite establecer la presencia de congéneres o compuestos relacionados aunque solo se disponga de patrones de la toxina cabeza de serie.
Existen diferentes tipos de espectrómetros de masas disponibles comercialmente (cuadrupolo sencillo, triple cuadrupolo, trampa iónica, etc) que difieren principalmente en la sensibilidad y en la capacidad para fragmentar los iones, proporcionando información estructural y una detección selectiva de las toxinas. La denominada ionización con electrospray (ESI) es la fuente de ionización a presión atmosférica (API) más utilizada para la detección de toxinas marinas, si bien otras fuentes tales como la ionización química a presión atmosférica (APCI) han sido también utilizadas para la determinación de este tipo de moléculas. Se han desarrollado diferentes métodos que difieren en la fase móvil, tipo de tampón, pH, fuerza iónica, fase estacionaria y modo de utilización de la fuente ESI (positivo ó negativo) para la detección del ácido okadaico, DTX1 y DTX2, (Pleasance el al., 1990, 1992;
Quilliam et al., 1995; Draisci et al., 1998b; Suzuki and Yasumoto, 2000) “DTX3” y diol ésteres (Hu et al., 1992b; Marr et al., 1992; Suzuki et al., 2004), pectenotoxinas (Suzuki et al., 1998; Suzuki and Yasumoto, 2000), Yesotoxinas (Draisci et al., 1998b) y azaspirácidos (Ofuji
et al., 1999; Draisci et al., 2000). El método de Ofuji (1999) ha sido aplicado con éxito en
varios trabajos que forman parte de esta tésis doctoral para la determinación de pectenotoxinas, ácido okadaico y DTX2 en arrastres fitoplanctónicos, en células aisladas por micromanipulación, de diferentes especies de Dinophysis y en extractos de hepatopáncreas de mejillón (Fernández et al., 2003a, 2006).
Un aspecto importante que debe ser considerado en la aplicación de estas técnicas es que la eficiencia de la ionización de los analitos puede verse afectada de manera significativa debido a diferentes componentes de la matriz que pueden coeluir con las sustancias de interés, bien por una inadecuada separación cromatográfica, bien por ser acumulados en la columna cromatográfica después de sucesivas inyecciones. La inclusión de procesos intermedios de limpieza y purificación de las muestras mediante extracción en fase sólida se ha utilizado para para eliminar el efecto de la matriz (Ofuji et al., 1999; Suzuki and Yasumoto, 2000). La magnitud de las interferencias puede variar en función de las diferentes matrices. Este efecto ha sido descrito por Ito and Tsukada (2001), que concluyeron que la supresión de la eficiencia de la ionización originada por sustancias co-eluyentes podía causar variaciones significativas en la respuesta del detector, dificultando la cuantificación mediante el simple uso de soluciones puras de estándares. Se ha sugerido el método de adición para la cuantificación de las toxinas DSP (Stobo et al., 2005).
La cromatografía líquida de alta eficacia acoplada con la espectrometría de masas está empezando a ser utilizada en los programas de monitorización de toxinas lipofílicas en países como Nueva Zelanda para la gestión de las zonas de producción de bivalvos (McNabb and Holland, 2003) y como complemento del bioensayo en ratón en algunos países de la UE (Hess
et al., 2003).
5. ACUMULACION, TRANSFORMACIÓN Y ELIMINACIÓN DE LAS TOXINAS