En este trabajo demostramos que dos cepas NCP del genotipo 2, una de alta virulencia (NY-93) y un aislamiento local de baja virulencia (98-124) son capaces de infectar ratones
121 BALB/c y de producir una viremia sostenida sin el desarrollo de signos clínicos y sin evidencias contundentes de afectación orgánica.
Seong y colaboradores, quienes por primera vez en 2015 [145] presentaron el modelo que hemos puesto a punto en nuestro laboratorio, no realizaron una curva de viremia como la presentada en este estudio. Ellos detectaron genoma viral en sangre de forma esporádica y no en todos los animales, incluso con resultados variables según la cepa infectante. La infección intranasal resultó en una viremia ocasional en algunos animales mientras que la aplicación IP fue más consistente. Nuestro estudio muestra que todos los animales que recibieron virus por vía IP, independientemente de la cepa utilizada, desarrollaron viremia y que la cinética no varió entre animales. Nuestro modelo es consistente en cuanto a las curvas de viremia que permiten un análisis adecuado de los tratamientos ulteriores, considerando este parámetro. Tanto nuestros resultados como los del grupo coreano evidencian la necesidad de caracterizar cada cepa particular ya que el comportamiento de las mismas puede ser sumamente variable.
En este trabajo, nosotros encontramos que únicamente la cepa de baja virulencia de tipo 2, considera una cepa “típica” en cuanto a su inmunopatogenia [21], induce una respuesta pro-inflamatoria sistémica en los ratones infectados, pero no la de alta virulencia. Seong y col. [145] observaron que dos cepas NCP del VDBV del genotipo 1 y 2 desarrollaron diferencias en la respuesta inmune innata, con un efecto regulatorio negativo para la cepa de tipo 2, comparada con la de tipo 1. También encontraron que la cepa NCP del VDVB-2 indujo la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Probablemente la cepa utilizada por Seong y col. se suscriba dentro de las cepas típicas de este genotipo. De hecho, a nivel del genoma, esta cepa presenta un 88% de homología con la cepa 98-124 y solamente un 77% con NY-93.
Seong y col. [145] detectaron al virus en el bazo y nódulos linfáticos mesentéricos en cuatro de los 6 ratones infectados, y solamente un animal infectado con una cepa NCP presentó virus en las células epiteliales del pulmón. Nuestros esfuerzos por localizar al VDVB en los diferentes tejidos del ratón fueron infructuosos. El grupo de Seong logró detectar antígenos del VDVB en tejidos mediante inmuno-histoquímica, una técnica mucho menos sensible que el RT-nested PCR utilizado en este trabajo. A nuestro entender es probable que no hayamos tomado las muestras al momento adecuado, ya que si bien nos guiamos con el trabajo de Seong y col., existen diferencias entre las diferentes cepas.
No pudimos confirmar la presencia de lesiones histopatológicas asociadas al VDVB en los órganos estudiados. Si bien en algunos animales se observaron cambios histopatológicos en bazo, los patólogos que analizaron los cortes histológicos no fueron concluyentes en cuanto a una asociación directa entre dichos cambios y la infección. Trabajos más antiguos demostraron que la infección de animales no-artiodáctilos con pestivirus produce cambios histopatológicos. Bachofen y col. demostraron que después de la exposición de conejos al VDVB [178], se produjeron cambios histológicos en órganos linfoides, que además resultaron positivos al virus por RT-PCR. Sin embargo, es muy probable que estos cambios existan y no fueron detectados por el tiempo en que se realizó la ablación de los órganos. Además del tiempo de ablación otro factor que pudo haber influenciado los resultados obtenidos en este trabajo pudo ser diferencias en la virulencia y en el tropismo de las cepas utilizadas. En nuestro caso, usamos un stock de virus que fue eficiente en reproducir la
DISCUSIÓN
122 enfermedad en terneros [133]. Información obtenida en nuestro laboratorio indica que cepas adaptadas a cultivo son menos eficientes en infectar células inmunes bovinas ex vivo, por lo que es importante además tener en cuenta que preparados virales con diferente historia de pasajes en hospedadores naturales, células inmunes en cultivo primario o bien en líneas celulares pueden resultar en diferente inmunopatogenia en los no-artirodáctilos.
El hallazgo de nuestro trabajo fue que ambas cepas evaluadas desarrollaron viremia en todos los ratones infectados. La diferencia entre ambas cepas es el momento en el que se produce el pico de viremia, que se inicia a los 4 dpi para NY-93 y a los 2 dpi para 98-124. Probablemente la cepa NY-93 de alta virulencia infecta con una cinética más acelerada. En ambos casos, sin embargo, los valores de viremia en el pico máximo son similares. Este resultado es equivalente al descrito en el modelo bovino [133], donde la viremia se inicia antes para NY-93 que para 98-124 pero con valores similares de titulo viral en sangre. En los bovinos, la infección por la cepa de baja virulencia se resuelve en 3-4 días, y la de baja virulencia se mantiene en circulación hasta 10 días. Los ratones, sin embargo, fueron incapaces de resolver la viremia. De hecho, un punto sumamente relevante de nuestro trabajo ha sido determinar la capacidad del VDVB de persistir en los ratones hasta por lo menos 60 días post-infección. Se realizó eutanasia a los 60 dpi, sin poder detectarse virus en ningún órgano por RT nested PCR. Trabajos realizados en nuestro laboratorio muestran que el VDVB es capaz de infectar células dendríticas de ratón sin causar la muerte de estas células [179]. Es posible, entonces, que la persistencia viral sea sostenida por las células dendríticas. Se precisan más experimentos para probar esta hipótesis.
En conjunto, nuestros resultados indican que el virus podría persistir en los ratones y abre una nueva aplicación del modelo que nunca ha sido reportado y que habrá que explorar oportunamente. Este es el primer trabajo en caracterizar la infección de un animal no- artiodáctilo con una cepa argentina del VDVB, y el primero en comparar el efecto de la infección en ratones de dos cepas del genotipo 2 de diferente virulencia, bien caracterizadas tanto in vitro como in vivo, en bovinos.