FISHING AND AQUACULTURE

3.9.1 Tratamientos térmicos

Después de evaluar la viabilidad de los nematodos a temperaturas superiores a la óptima (25°C), se determinaron las tolerancias de los aislados al calor mediante la expresión de proteínas de choque calórico (Hsp70 y Hsp90).

Así, de acuerdo a la técnica descrita por Selvan et al., (1996), 5,000 juveniles infecciosos de cada uno de los aislados, se depositaron en microtubos de 1.5 ml con

1 ml de agua destilada estéril y se expusieron a temperaturas constantes de 25, 30, y 32 °C durante 3 horas, con cuatro repeticiones. Además de un tratamiento de preacondicionamiento que consistió en exponer los aislados a 25, 30, 25, 32 y 25ºC durante 30 minutos en cada temperatura y finalmente a 35°C durante 3 horas. Los testigos fueron los aislados sometidos a 25°C.

Los tratamientos se desarrollaron en estufas donde las temperaturas se estandarizaron durante las 24 horas previas al experimento, posteriormente, dentro de ellas se colocaron vasos de precipitado con capacidad de 1,000 ml con 500 ml de agua, tapados con membrana plástica (Plastipack ) durante 24 horas, dentro de los vasos se efectuó la lectura de la temperatura del agua con un termómetro, en estos vasos se depositaron los microtubos con los nematodos, en cada una de las temperaturas mencionadas en el párrafo anterior, de acuerdo a la técnica descrita por (Snutch y Baillie, 1983)

3.9.2 Marcaje metabólico con metionina marcada con azufre 35

Con la finalidad de determinar la síntesis de nueva proteína Hsp70 y Hsp90 como producto del estrés a temperaturas superiores de 25°C, se colocaron 5,000 nematodos de cada aislado en microtubos de 1.5 ml, a los cuales se les agregó medio de cultivo RPMI 1640 adicionado con suero fetal al 5% y antibióticos y

metionina marcada con azufre35 (5 µCi/ml) para posteriormente, someterse a los

tratamientos térmicos de acuerdo a Harlow y Lane (1988).

Después del proceso de estresamiento, el medio de cultivo se eliminó de los microtubos mediante dos lavados con un buffer fosfato salino (PBS 0.3%), para lo cual se agitó en el vortex y se centrifugó por 5 segundos a 14,000 r.p.m., posteriormente las muestras se guardaron a una temperatura de –20ºC (Harlow y Lane, 1988).

3.9.3 Lisis de los nematodos

La lisis de los nematodos se realizó en forma manual, con un mortero congelado con capacidad de 250 ml durante un tiempo de aproximadamente 5 minutos hasta que el pellet de nematodos se desintegró, durante este proceso de lisis, se les agregó a cada aislado 7 ml de buffer de lisis Triton X-100, al cual se agregó 1mM de inhibidor de proteasas (PMSF) de acuerdo a Harlow y Lane (1988).

Una vez que el pellet se molió, el extracto se depositó en microtubos de 1.5 ml a través de micropipetas con puntas de 200 µl, las muestran se centrifugaron durante 15 segundos a 14,000 r.p.m. para separar el sobrenadante, el cual se depositó en microtubos y se congeló a –20°C, posteriormente se liofilizaron durante 6 horas a una temperatura de –50 ºC, con la finalidad de concentrar la proteína (Harlow y Lane,1988)

3.9.4 Determinación de proteínas

Con el propósito de determinar la concentración de proteína de las muestras que fueron lisadas, se utilizó el método de Bradford (1976), el cual determina las uniones del tinte azul brillante de coomassie a la proteína, y comparar estas uniones a las de diferentes cantidades de la proteína estándar de albúmina de suero bovino (BSA).

En microtubos de 1.5 ml se depositaron 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5 y 20 µl de la solución BSA, y se completaron los volúmenes hasta 100 µl con NaCl 0.15 M, se usó como blanco 100 µl de NaCl 0.15 M. Posteriormente se añadió 1 ml del reactivo de Bradford a cada tubo y se tomaron los valores densitométricos en el espectrofotómetro a 595 nm. Con los valores obtenidos se realizó una gráfica de la curva en el programa de cómputo Instat versión 3.5. Estos valores permitieron determinar la cantidad de proteína de cada aislado, en su tratamiento respectivo.

Las proteínas de cada aislado se separaron mediante electroforesis en una unidad de minigel vertical Bio Rad, y se utilizó la técnica SDS-PAGE de Laemmli (1970). Por cada aislado de nematodos se utilizaron 30 µg de proteína /carril, en un carrid de cada gel se añadió marcador de peso molecular.

Para preparar el gel separador se mezclaron en un vaso de precipitado, 3.3 ml de acrilamida 30 % bisacrilamida 0.8%, 2.5 ml tris 1.5 M pH 8.8, 100 µl de SDS 10%, 5

µl de temed, 4.05 ml de agua destilada y 50 µl de persulfato de amonio 10 %, se

agitó suavemente y se vació sobre el cassette a una altura de 8 cm y se agregó SDS 0.1% como linealizador para auxiliar en la rápida polimerización del gel separador.

Inmediatamente después se preparó el gel concentrador (4.0 % de acrilamida), para lo cual se mezcló, 1.33 ml de acrilamida 30 % bisacrilamida 0.8 %, 2.5 ml de Tris 0.5 M pH 6.8, 6.1 ml agua destilada, 100 µl de sds 10%, 10 µl de temed, y 50 µl de persulfato de amonio al 10 %, se agitó suavemente y se vació en el cassette una vez que se retiró el linealizador.

Inmediatamente, se colocó el peine y se dejó polimerizar durante 40 minutos. Después de la polimerización se removieron los peines y se enjuagaron los pozos con buffer de corrida. A los extractos de los aislados se les agregó buffer de muestra y se colocaron en agua hirviendo durante 5 minutos y se cargaron sobre el gel concentrador con una jeringa Hamilton de 100 µl, la punta de la jeringa se colocó en la base del pozo, para descargar la muestra, posteriormente, los pozos se llenaron con buffer de corrida, y se colocaron los cassettes en el montaje del electrodo para llevar a cabo la corrida, misma que se desarrolló durante 6 horas a 60 V.

Con la finalidad de transferir las proteínas contenidas en el gel de poliacrilamida al papel de nitrocelulosa, se efectuó la electrotransferencia de acuerdo al método de Towbin et al., (1979). En este proceso se utilizó un equipo de transferencia BioRad, el cassette se ocupó con un cojín, un papel filtro, el gel producto de la electroforesis y el papel de nitrocelulosa (Hybond -C, RPN 303C, Amersham), a continuación un papel filtro, y finalmente un cojín, en una orientación de positivo a negativo; posteriormente, se llenó con buffer de transferencia (Tris 0.025 M, Glicina 0.192 M y Metanol 10 %), y se corrió a 24 V durante 12 horas, a 4ºC.

3.9.7 Inmunodetección de proteínas transferidas a papel de nitrocelulosa

Una vez que finalizó el proceso de electrotransferencia, el papel de nitrocelulosa con las proteínas transferidas se cubrió con una solución de PBS-leche descremada al 3% durante 12 h, después de este período, el papel se lavó 2 veces con PBS-Tween 20 al 0.3 % y PBS durante 5 minutos c/u, posteriormente se agregaron los anticuerpos específicos Hsp70 (Sigma H-5147) o Hsp90 (Sigma H-1775) que previamente habían sido diluidos a una razón de 1:5,000 en una solución PBS- leche descremada al 0.3 %, el proceso de incubación duró 1 h en agitación constante, a temperatura ambiente, después de la incubación se lavó el papel 2 veces con PBS-Tween 20 al 0.3 % y 3 veces con PBS durante 5 minutos c/u, de manera alterna con la solución anterior. Posteriormente se continuó con la incubación del segundo anticuerpo conjugado con la peroxidasa diluido a 1:1,000 en PBS-leche descremada al 3 % durante 1 hora, a temperatura ambiente y con agitación.

Posteriormente, se lavó el papel de nitrocelulosa cinco veces durante 5 minutos cada una con PBS-Tween 20 al 0.3 % y 6 veces durante 5 minutos cada una con PBS en forma alterna con la solución anterior, luego los papeles de nitrocelulosa se orearon durante 3 minutos y se metieron en un recipiente de cristal el cual contuvo 4 ml del reactivo quimioluminescente (ECL, Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, England) durante 2 minutos.

3.9.8 Autoradiografía y Densitometría

Esta técnica se utilizó para determinar sí durante el estrés calórico, las células de los nematodos sintetizaron nuevas proteínas, las cuales incorporaron el aminoácido marcado con azufre 35. El papel de la nitrocelulosa conteniendo las proteínas se expuso a una película fotográfica (Dupont de Neumors USA) por espacio de 60 días. El revelado se hizo con revelador Kodak GBX #616-0832 y fijador Kodak GBX # 616- 2911 (Swanstrong y Shank 1978), Posteriormente, las placas autoradiógraficas se analizaron y cuantificaron las manchas por medio de densitometría.

Los valores obtenidos de las manchas de proteína se normalizaron partiendo de los valores del control a los cuales se les dio un valor de 1, esto con la finalidad de observar el posible incremento de la expresión de las proteínas de choque calórico (Shen y Lee, 1997). Con la finalidad de determinar diferencias estadísticas significativas entre los efectos de las diferentes temperaturas sobre la expresión de la proteína, las unidades experimentales fueron distribuidas en un diseño completamente al azar con 8 tratamientos y diferente número de repeticiones (2-4) y los promedios fueron separados mediante pruebas de rango múltiple de Tukey (P< 0.05).

IV. RESULTADOS