El punto de partida de este trabajo, son los resultados obtenidos tras un rastreo de in
vivo de más de 15.000 moléculas químicas diferentes llevado a cabo en nuestro
laboratorio mediante el uso de moscas DM1 espliceosensoras. Estas moscas transgénicas expresan el minigen humano del receptor de la insulina (INSR) fusionado al gen reportero luciferasa, de forma que cambios en el splicing del minigen provocan cambios en los niveles de expresión del reportero. Tras clasificar los compuestos incluidos en el rastreo por el valor de su Z-score, seleccionamos como positivos aquellos compuestos capaces de aumentar los niveles de luciferasa por encima de 3 desviaciones típicas, es decir con un Z-score de 3 o superior. Así, identificamos 126 compuestos como positivos primarios. Cabe destacar que la boldina, molécula sobre la que se centra el presente trabajo, no se incluyó inicialmente en el grupo de compuestos activos.
Sin profundizar en el diseño racional del rastreo de compuestos anteriormente citado, es remarcable citar que el uso de moscas espliceosensoras ofrece la posibilidad de identificar moléculas activas por diferentes mecanismos, ya que el fenómeno modelizado abarca una aproximación basada en un fenotipo ligado a una alteración en el splicing inducida por las repeticiones CUG, sin conectar la actividad del compuesto evaluado con un mecanismo de acción específico. Respecto al hecho de que se tomara un proceso de splicing alternativo como diana del ensayo, es remarcable que aunque se han descrito algunas diferencias a nivel de splicing alternativo entre Drosophila y mamíferos (Mount et al., 1992; Irion, 2012), existe una gran conservación entre los mismos (Venables et al., 2012). Además, el hecho de que este rastreo haya identificado compuestos que se han confirmado como activos en ensayos secundarios, muestra que, en las condiciones específicas del ensayo, las diferencias en la maquinaria del splicing de las moscas espliceosensoras no son significativas, por lo que estas moscas reflejan lo ocurrido en DM1 en condiciones humanas.
El cabeza de serie de los compuestos seleccionados en el rastreo primario fue la estefenantrina, un fenantreno de origen natural y estructura conocida cuya actividad anti-DM1 parece estar relacionada con un mecanismo de acción aguas arriba de la ruta patológica descrita en DM1: la unión de forma específica a la horquilla tóxica formada por las repeticiones. Esta molécula reduce los foci ribonucleares y mejora el splicing de diferentes transcritos en células de pacientes. Además, mejora un aspecto funcional de la enfermedad como es la miotonía en ratones modelo DM1 de forma dependiente de dosis tras su administración intramuscular (manuscrito en preparación).
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En el diseño tradicional de fármacos, una vez encontrado y definido el cabeza de serie, el siguiente paso es el estudio de su estructura con el fin de encontrar el conjunto de grupos relevantes de la molécula que interactúan con el receptor y que se pueden considerar responsables de su actividad biológica. Para ello, una primera aproximación se basa en la determinación de la actividad de diferentes compuestos análogos, lo que permite a su vez extraer conclusiones sobre las relaciones entre la estructura y la actividad biológica de una serie de compuestos parecidos en estructura química (Galbis, 2004).
De cara a la selección de moléculas análogas a la estefenantrina, un primer paso lógico y que nos permitía aprovechar los resultados que ya teníamos, fue la búsqueda de compuestos con una estructura similar dentro de las más de 15.000 moléculas incluidas en el rastreo primario. Estas moléculas, procedentes de diferentes librerías químicas y con orígenes diversos, suponían una gran fuente de diversidad química en la que buscar análogos además de tener un peso molecular pequeño, óptimo para su posterior desarrollo farmacológico. Así en un segundo análisis de los resultados obtenidos en el rastreo primario buscamos moléculas análogas a la estefenentrina identificamos la boldina, una molécula con un valor de Z-score en el rastreo primario muy cercano al umbral marcado para la determinación de compuestos positivos. A fin de descarta que la boldina pudiera ser un falso positivo, siguiendo el protocolo establecido para los 126 compuestos identificados como activos, la actividad de la boldina observada en el rastreo primario así como la de otros 32 compuestos, quedó validada en diferentes ensayos espliceosensores independientes. Este hecho, evidenció el potencial del rastreo de compuestos en moscas espliceosensoras para la identificación de compuestos similares con una misma actividad, y nos llevó a abrir una nueva línea de trabajo enfocada en la caracterización y validación de la actividad anti DM1 de la boldina.
Lo siguiente a confirmar, fue que los resultados obtenidos no eran debidos a una acción inespecífica del compuesto alterando los niveles de (CUG)480 al interferir con la
síntesis del factor Gal4 y/o con su unión a la secuencia reguladora UAS, disminuyendo así la expresión del transgén. El análisis del efecto de la boldina sobre los transgenes UAS-CTG480 y UAS-INSR:Luc de forma independiente nos permitió comprobar que en
efecto, los resultados obtenidos en el rastreo primario eran debidos a un efecto de la boldina sobre el splicing del minigén del receptor de la insulina en presencia de las repeticiones CTG. Así mismo, nos planteamos que la actividad de la boldina observada también podría ser debida a una reducción de la tasa de transcripción global si su acción afectase de alguna manera a componentes específicos de la maquinaria de transcripción/traducción. Este tipo de efecto inespecífico es el producido por los inhibidores de las proteínas Histona Deacetilasas (HDAC), los cuales reducen la tasa de transcripción celular y han mostrado ser eficaces en modelos de Huntington en
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la actividad de la proteína reportera luciferasa expresada en la musculatura (MHC- Gal4>UAS-Luc), lo que descarta tanto un efecto del compuesto sobre la transcripción total o específica del sistema UAS/Gal4, como una acción de la boldina sobre la estabilidad o actividad de la luciferasa.
De este modo, tras distintos ensayos que descartaron cualquier tipo de falso positivo durante el proceso de screening primario, la actividad de la boldina quedó validada.
2. El tratamiento con boldina revierte fenotipos moleculares alterados en DM1 tales