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Con el fin de evaluar la capacidad antagonista de los 6 aislamientos de Trichoderma frente a R. Solani en plantas de clavel, se tomaron cada 4 dìas registros de:

Altura de la planta Longitud parte aérea Longitud raíz

Incidencia de la enfermedad (% plantas vivas

)

Síntomas: Amarillamiento, marchitamiento, necrosis de tejidos. Peso fresco total

Peso seco parte aérea Peso seco de raíz Peso seco total

Los tratamientos control corresponden a:

Control de infección: Plantas con el patógeno Rhizoctonia solani Control de crecimiento: Plantas sin patógeno ni antagonista Control Trichoderma: Plantas con el aislamiento T235

Con los valores obtenidos durante el estudio para las variables medibles se llevó a cabo un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los tratamientos mediante la prueba de tukey, tanto para los análisis “ in Vitro como para los “ in vivo “.

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La expresión de necrosis (muerte del tejido) sugiere la presencia de metabolitos difusibles y altamente tóxicos de carácter enzimático (Celulasas, Quitinasas y Proteasas) acompañados por otros compuestos encargados de la inhibición del crecimiento como acido harzianico, alamenticinas, peptaiboles, antibióticos, 6-pentil- -pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperinas, acido hepteldico y otros (Benitez, et al., 2004; Harman, et al., 2004; Limón, et al., 2004; Rey, et al., 2000; Cook y Baker, 1983 ; Cundom, 2003),afirman que la velocidad de crecimiento presentadas por las especies de Trichoderma son motivos para la utilización de este microorganismo como antagonista, para el control de fitopatógenos.

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AISLAMIENTO 24 HORAS 48 HORAS 72 HORAS

T3 15,33 56,33 62,33 TSP5 14,00 36,33 48,67 TV1 12,00 27,67 42,00 TC1 11,00 30,33 40,00 Ti1 14,33 33,67 41,00 T235 24,00 61,67 63,67 ) ( * "+ +,!'"

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Estos resultados muestran el alto grado de patogenicidad que puede ejercer este hongo fitopatógeno cuando encuentra acción directa sobre ó sin la eficiente acción biocontroladora por parte de hongos antagonistas ( Figura 13). Barrera et al.,1997, afirman que la aparición de los primero síntomas, se ve influenciado por la agresividad del aislamiento del patógeno.

Durante la tercera semana de evaluacion se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos: control de crecimiento. control de infeccion y control con Trichoderma. Las plantas de clavel en el control de crecimiento presentaron un crecimiento a nivel radicular y de la parte aérea progresivo en el tiempo y mayor al control de infeccion (Figura 13I), sin embargo el crecimiento de las plantas fue menor, en comparación con todos los tratamientos de Trichoderma excepto para el tratamiento con Tsp5 ( Figuras 13 y14).

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Por otra parte, la acción positiva ejercida por el hongo antagonista, se ve

reflejada en el control Trichoderma, donde se observa una mejor apariencia y

calidad en los esquejes, así como un mayor crecimiento total, al ser comparada con los controles ( Figuras 13H y 14). A su vez, el control de infeccion presentó los menores niveles de crecimiento, (Figura 13G), amarillamiento y marchitamiento progresivo en los esquejes.

Los tratamientos con el aislamiento T3 y el Control Trichoderma, mostraron los mejores resultados en cuanto al crecimiento total y apariencia de las raíces de las plantas evaluadas al final de la tercera semana, si se compara con los demás tratamientos de Trichoderma y controles de crecimiento e infeccion (Figuras 13ª y 13H). Esto confirma además los resultados obtenidos al evaluar

el crecimiento libre in vitro donde se observó que los aislamientos T3 y T235 tuvieron un mayor crecimiento y un alto PIM sobre el patógeno R.solani (Tabla 3, Figura 3).

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En general todos los tratamientos con Trichoderma, a excepción de Tsp5, muestran una buena apariencia, calidad en los esquejes, un mayor crecimiento aéreo y radicular, así como ausencia de signos o síntomas de la enfermedad por R .solani. Estos resultados confirman los obtenidos en las pruebas de antagonismo in vitro ( Figura 4-5), que demuestran la excelente actividad antagonista ejercida por las especies de Trichoderma sobre el hongo R.solani. Estos son indicativos favorables de la actividad del hongo como promotor del crecimiento y agente antagonista en campo, sobre R.solani en esquejes de clavel variedad Everest. El aumento de vigor observado en las plantas inoculadas con Trichoderma, se ve reflejado en el crecimiento de la parte aérea y radicular en el control con Trichoderma, el cual muestrà un crecimiento de 16,1 cms y 6,1 cms respectivamente, si se compara con los obtenidos con el control con el patógeno el cual mostrò para estas mismas variables, resultados de 15,3 cm y 4,9 cms respectivamente ( Figura 13 -14) ( Anexo 1). Estos resultados coinciden con los descritos por López et al., 1999, el cual establece que

Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las plantas, que actúan como catalizadores o aceleradores de los tejidos meristemáticos primarios ( los que tienen potencial de formar nuevas raíces) en las partes jóvenes de éstas, acelerando su reproducción celular, logrando que las plantas alcancen un desarrollo más rápido que aquellas plantas que no han sido tratadas con dicho microorganismo.

De la misma forma que lo observado al día 15, en el día 19, la patogenicidad del hongo se mantiene en las plantas con los tratamientos Control R. solani y Tsp5. Esto fue evidenciado por una apariencia débil de los esquejes y una menor tasa de crecimiento, además se presentó amarillamiento, marchitamiento progresivo, necrosis de tejidos y muerte en plantas ( Figura 19). Estas observaciones concuerdan con los resultados obtenidos para este tiempo, respecto a la longitud de la parte aérea, ( Figura 10), donde se manifiesta que la acción patógenica sobre el control R.solani y Tsp5 , queda reflejada en el menor valor de crecimiento de los esquejes (Figura 13B-13G ). Los síntomas observados en las plantas de clavel en el día 19, han sido reportados anteriormente por otros investigadores como Garibaldi et al.,1978,

quien define que la enfermedad causada por Rhizoctonia solani incluye el marchitamiento lento fungoso que se caracteriza por la reducción en el crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan posteriormente, causando que la planta se marchite y muera.

En la figura 15 se muestran los efectos de la aplicación de los diferentes

aislamientos de Trichoderma sobre el peso fresco de los esquejes de clavel,

así como de la acción antagonista ejercida por los diferentes tratamientos frente al hongo fitopatógeno R.solani. Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma T235 presentaron diferencias significativas 8 p<0.05) con relación al control de infección.

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Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma presentaron los mayores valores de longitud de la parte aérea, longitud total y peso fresco total (Figuras 10 y 13 y 15) así como altos valores en cuanto a la longitud radicular (Anexos 1A, 1B y 1C) estos resultados se ven reflejados en esquejes con mejor apariencia y crecimiento, follaje abundante y una mayor biomasa radicular (Figuras 13 y 18). Por otra parte el tratamiento con el aislamiento Tc1,

presentó valores significativamente altos para las variables de peso fresco ( Figura 15)(Anexo 1C ). Varios autores han demostrado que la adición de aislamientos específicos de Trichoderma en la rizósfera pueden resultar en promoción de crecimiento en plantas ; Bailey et al., 1998; Bjorkman et al., 1998;

Yedidia et al., 1999; Harman, 2000; Naseby et al., 2000; Rojo, et al., 2006). Es

interesante anotar que a partir de la tercera semana se observa un crecimiento significativo en la longitud y el peso de las plantas de clavel con el tratamiento TC1, logrando alcanzar niveles similares para los observados en el control Trichoderma y el aislamiento T3 (Figura 15). Al parecer la acción promotora del crecimiento de Tc1 sobre los esquejes de clavel es un poco más lenta en el tiempo, si se compara con las demás cepas de Trichoderma utilizadas, ya que solo a partir de la segunda a tercera semana se evidencia una real actividad de crecimiento de los esquejes de clavel, Estos resultados difieren notablemente de los obtenidos in vitro, donde se estableció que la menor tasa de crecimiento libre de las sps de Trichoderma cultivadas en el tiempo perteneció a la cepa TC1 (Figura 2, Tabla 3). Se confirma lo observado por otros autores (McLeod et al., 1995; Smith et al., 1990) respecto a que la selección previa de antagonistas mediante cultivos duales es útil, pero no garantiza el comportamiento de éstos en invernadero.

En la cuarta semana se confirma la capacidad antagonista in vivo en los

tratamientos con Trichoderma donde se observó un desarrollo normal de las

plantas, con hojas, tallos y raíces saludables (Figura 16). Los esquejes de clavel en los tratamientos T235 y control Trichoderma siguen presentando el mayor índice de crecimiento (Figura 16E-16F), reflejado en mayores valores de peso seco de raíz y parte aérea (Figuras 17,18 ). Yedidia, et al., en 1999, en trabajo con Trichoderma harzianum afirman que esto es debido posiblemente a que Trichoderma penetra y se desarrolla en la epidermis exterior, estimulando el sistema de defensa de la planta por cambios metabólicos. por otra parte, Arora et al. en 1992, afirma que la colonización de raíz por cepas de Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de raíz en muchos cultivos de plantas bajo condiciones de invernadero.

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Vale la pena resaltar que entre los días 19 y 23, se encuentran los resultados de mayor relevancia respecto al aumento en el crecimiento. Se observa que

para los tratamientos Control Trichoderma, T3 y T235, se encontraron

aumentos cercanos al 43%, 40% y 39% respectivamente (Anexo 1C), mucho mayores al encontrado en el control del patógeno que mostró un rendimiento negativo a nivel de crecimiento para este tiempo. Estos resultados son concordantes a los encontrados para la variable de peso fresco, que mostraron

aumentos de 35,7%, 32% y 34% para el control con Trichoderma, T3 Y T235

respectivamente. Por otra parte los resultados obtenidos para peso fresco en el Control de crecimiento y control R.solani 20% y 11.7% respectivamente, fueron mucho menores a los encontrados en los aislamientos con el hongo de Trichoderma. Estos resultados confirman aún más la acción promotora del crecimiento vegetal en esquejes de clavel por parte de las diferentes aislamientos de Trichoderma, así como el efecto antagonista ejercido por el hongo, sobre el fitopatógeno R .solani. Benitez et al., 2004; Sunil et al., 2005, determinan que la productividad de cultivos en campo puede incrementarse cerca del 300% después de la adición de Trichoderma hamatum o Trichoderma koningii.

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El peso seco de la parte aérea y de las raíces de las plantas inoculadas con Tc1 y el control con Trichoderma, se diferenció claramente de las inoculadas sólo con el patógeno, observándose un desarrollo significativo de raíces y parte aérea en presencia de estos tratamientos( Figuras 17-18) ( Anexo 1,Tabla 1E- 1F). Harman et al., en 1998, determina que la promoción del crecimiento

vegetal por parte de Trichoderma se manifiesta como una potenciación de la

germinación de las semillas, una floración más abundante y temprana y aumentos de altura y peso de las plantas ( Vhang y Baker, et al.,1986).

Por otra parte el Control con R.solani evidenció la presencia activa del patógeno sobre la base del tallo, asi como procesos de amarillamiento, marchitamiento y valores de mortalidad alta sobre los esquejes de clavel

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En los tratamientos con el control con Trichoderma, asi como con los aislamientos T3 Y T235 se obtuvo una mayor respuesta en cuanto a niveles de crecimiento de la parte aérea y radicular de los esquejes de clavel, comparado con el control de crecimiento y con el control de infecciòn ( Figura 9 ) ( Figura 23). Se pudo evidenciar entonces, el alto grado de biocontrol ejercido por parte de las cepas de Trichoderma sobre el hongo R. solani, excepto el aislamiento Tsp5. Esto se confirmò por la apariencia saludable de las plantas, ausencia de síntomas de la enfermedad y valores superiores de las variables de longitud de la parte aérea y peso evaluadas, con relación a los tratamientos control de crecimiento y control de infección hacia el dìa 23 del ensayo. Algunos autores

han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas por parte de Trichoderma spp., es así como Yossen et al.,en 2003 demostraron que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, además de reducir el daño causado por R. solani, el antagonista promovió el crecimiento de las plantas. Igualmente Inbar et al., en 1994., observaron que aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentón se incrementó significativamente el crecimiento de las plántulas, comparadas con aquellas que no recibieron la adición del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el

beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, para obtener plantas vigorosas y sanas ( Castro 2005).

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La apariencia y calidad de los esquejes, síntomas visibles de amarillamiento, y marchitamiento, así como tejidos necrosados, la disminución en la calidad y cantidad de las raíces y muerte en los esquejes de clavel (Figura 19- 21), confirma la actividad del hongo fitopatógeno , durante los ensayos en invernadero, para los tratamientos con el control R.solani (Figura 19 A y B) y el Tratamiento con el aislamiento Tsp5 ( Figura 19 CyD). Benitez et al., 2004, establece que las cepas de Trichoderma pueden colonizar raíces de plantas en crecimiento y proteger contra infecciones. La colonización implica la habilidad para adherirse y reconocer raíces de plantas, penetrar la planta y resistir metabolitos tóxicos producidos por las plantas en respuesta a la invasión de organismos extraños, sean o no patógenos.

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Se pudo determinar que las plantas con mayor peso seco fueron aquellas que

crecieron en los diferentes aislamientos con Trichoderma, especialmente con

el control de Trichoderma y T235 (Figura 20) ( Anexo 1G). Ahora bien, La evaluación del nivel de daño radical, mostró que este fue menor en presencia de los tratamientos con el hongo antagonista, que en el tratamiento con el control de infecciòn (Figura 20-22). Un ensayo realizado sobre pasto Estrella demostró que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos de Trichoderma es cercana al 23%, en longitud de las raíces y de estolones este incremento fue de un 30% ( www.infojardin.com/foro/showthread.php).

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La buena actividad biocontroladora ejercida por parte del hongo Trichoderma sobre el fitopatògeno R. solani (Figura 21, 24), quedó demostrado con la ausencia de sìngos y síntomas de la enfermedad, asi como la baja incidencia de muerte de los esquejes bajo la acción de las diferentes especies de Trichoderma a través del tiempo, a excepción de Tsp5, que a lo largo del ensayo demostró una baja acción antagonsita sobre R .solani ( Figura 19C,19D- 21). Tal y como lo establece Meera et al ., en 1994, quien determina que la acción de biocontrol ejercida por el hongo antagonista, puede ser debido

a que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir resistencia

sistémica de plantas, ya que aplicadas en la rizosfera producen protección contra patógenos del suelo o foliares.

No obstante al excelente antagonismo ejercido por Trichoderma, se pudo determinar una clara actividad patogènica del hongo R. solani en los esquejes de clavel, cuando este se aplico como tratamiento control ( Figura 19A,19B- 21). Castro y Osorio en 2005, demostraron el efecto antagónico de Trichoderma sobre R. solani en semilleros de café, obteniendo una reducción de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el hongo antagonista (T1664).

Es interesante notar que los resultados obtenidos durante la experiencia para el desarrollo radicular de los esquejes de clavel muestran que existió una actividad directa de Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en los esquejes de clavel y del aumento de la zona rizosfèrica ( Figura 22-23-24). La habilidad de cepas de Trichoderma para proteger plantas contra patógenos de raíces esta siendo atribuido a su efecto antagónico contra patógenos invasivos, Sin embargo esta asociación hongo-raíz además estimula mecanismos de defensa en plantas. ( Benitez., et al 2004)

T3 TSP5 Tc1

Tv1 Ti1 T235

Control Trichoderma Control R. solani Control de crecimiento

Figura 22 Apariencia de las raíces en los diferentes tratamientos.

De igual manera se observò que los tratamientos con el aislamiento T235 y el

control Trichoderma ( Figuras 22E, 22G y 23) mostraron los mayores valores

de longitud de raìz, además de una excelente apariencia de sus raíces. Así mismo el tratamiento Tc1 mostro valores significativos a nivel radicular durante las ultimas dos semanas de evaluacion. El mayor tamaño de raíces influye de manera directa en el crecimiento aéreo de la planta, tal y como quedo en el crecimiento de los esquejes con el control de Trichoderma demostrado en diferencias mayores al 25% respecto al control de crecimiento y del 75% aproximadamente para el control con R. solani (Figuras 22C,D y E y Figura 23)

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Benitez et al., 2004 en estudios con Trichoderma demostraron que la

colonización de raíces por este hongo frecuentemente incrementa el crecimiento y desarrollo de raíces, productividad de cultivos, resistencia a estrés abióticos y la toma y uso de nutrientes. De igual forma Bjorkman et al., en 1998 estableció una hipótesis en la que propone que Trichoderma es capaz de limitar el efecto del daño oxidativo en la raíz.

Para el dia 27 despuès de la aplicación del antagonista se confirmó el efecto ejercido por Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en plantas y antagonista del hongo fitopatogeno R .solani ( Figura 24). Se observa una excelente apariencia y calidad de los esquejes, así como un gran desarrollo de la parte aérea y radicular. Por otra parte para la última semana se hace mas evidente la acción patogénica de R. solani, sobre las plantas, evidenciado por el aumento en el número de marchitamientos y necrosamiento de tejidos, así como la muerte de esquejes ( Figura 19 y 21).

No obstante estos síntomas estuvieron ausentes durante el desarrollo del ensayo en las plantas bajo la acción del hongo Trichoderma, a excepción del aislamiento Tsp5

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Benitez et al., 2004, Yedidia et al., 2000 establecen que el rápido desarrollo y colonización de Trichoderma de las zonas adecuadas para la infección, como áreas de necrosis, heridas o partes concretas de la planta, impiden físicamente el acceso y establecimiento del patógeno en su hospedador.

Es claro que a pesar de la inoculación del hongo patógeno Rhizoctonia solani sobre los esquejes de clavel, el antagonista ejerció un biocontrol efectivo sobre el hongo fitopatógeno en condiciones de invernadero a lo largo del la investigación. Se encontrò que el tratamiento con el control con Trichoderma, mostró los mejores resultados respecto a crecimiento de la parte aérea y radicular (Figura 22)(Anexos1A-1B), evidenciado por un mayor crecimiento y un aumento en el crecimiento total de cerca del 46% respecto al control de crecimiento ( Figura 14) ( Anexo 1C); de igual manera reflejados en las mayores rendimientos en peso fresco y peso seco total frente a los controles del patógeno y de crecimiento ( Figura 15 y 20). Por otra se pudo confirmar que los mejores resultados en todas las variables evaluadas se obtuvieron en los aislamientos de Trichoderma ( T235 y T3). Estos resultados son consistentes con los obtenidos en los estudios in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), que demostraron que los aislamientos T235 y T3 presentaron las más altas tasas de crecimiento libre en el tiempo, del mismo modo el aislamiento T235

presentó el mayor PIM en las pruebas de antagonismo in vitro frente al hongo fitopatogeno R .solani. Vale la pena resaltar que el aislamiento con Tc1 mostró una buena actividad bajo condiciones de invernadero a partir de la segunda

semana, convirtiéndose junto al control con Trichoderma, T235 y el T3 en los

mejores aislamientos. No obstante a los buenos resultados obtenidos en campo para el aislamiento Tc1, estos difieren notablemente a los desarrollados in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), donde Tc1 mostrò los menores valores de crecimiento libre en el tiempo. Estos resultados confirman lo dicho por Macleod, quien establece que los resultados in vitro de especies de Trichoderma no garantiza plenamente su actividad y antagonismo sobre hongos fitopatógenos en condiciones de campo o invernadero. Por otra parte se puede inferir que el que el tratamiento Tsp5 no ejerció un biocontrol efectivo en esquejes de clavel para el control de enfermedades ocasionadas por el hongo fitopatógeno R. solani ( Figura 19,21); Siendo Tsp5 un hongo utilizado en cultivos de flores en la sabana de Bogotá, debería ejercer una acción efectiva sobre el fitopatógeno en cultivos de clavel, situación por la cual es evidente buscar alternativas tendientes a mejores rendimientos en pro del control de organismos fitopatógenos tales como R. solani, y que pudieran encontrar solución en el aislamiento nativo T235, el cual mostró los resultados más relevantes para el control del hongo patógeno en condiciones de invernadero y en la promoción del crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest.