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5.2.4.1. Preparación del inóculo

Las cepas CP1 (T. virens) y CP4 (T. viride) se crecieron en cajas de Petri con agar papa dextrosa (PDA Baker®) a 28 ºC por 5 días. Posteriormente, se preparó una suspensión de esporas de cada cepa, a partir de varios lavados con agua destilada estéril. Los fragmentos de micelio se removieron de la suspensión por filtración a través de fibra de vidrio estéril. La suspensión de esporas se ajustó a una concentración aproximada de 106 esporas mL-1.

5.2.4.2. Condiciones del cultivo

A frascos de vidrio de 150 mL de capacidad, se adicionaron 50 mL del medio mineral (g L-1) 0.1 CaCl2; 0.2 KCl; 0.5 KH2PO4; 0.5 (NH4)2SO4; 0.2 MgSO4.7H2O; 0.05

CuSO4; 0.05 ZnSO4; 0.43 MnSO4; 0.05 (NH4)6Mo7O24.H2O; 6 glucosa, pH 5.5.

Previamente, se prepararon soluciones stock de naftaleno, fenantreno y benzo[a]pireno a (20,000 mg L-1) disueltas en CH2Cl2. De cada una de estas soluciones se tomaron 250 µL,

y se adicionaron a los medios de cultivo correspondientes, para tener una concentración final de 100 mg L-1 de cada uno de los hidrocarburos poliaromáticos. Posteriormente, se

adicionó 1 mL de la suspensión de esporas (106 esporas mL-1) de las dos cepas de

Trichoderma, al medio de cultivo correspondiente.

Los 6 tratamientos (factorial 2x3, dos cepas fúngicas y tres hidrocarburos poliaromáticos) fueron incubados a 28 ± 2 °C a 150 rpm por seis días. Al término de la incubación se evaluó la biomasa fresca y seca, y el contenido de proteína fúngica (Bradford, 1976; Anexo II), además del pH del medio de cultivo.

5.2.4.3. Determinación de la cinética de consumo de glucosa en presencia de naftaleno, fenantreno y benzo[a]pireno

De las unidades experimentales utilizadas para la degradación de naftaleno, fenantreno y benzo[a]pireno se tomó una alicuota de 100 μL para la determinación de azúcares totales con el método de Dubois et al. (1956) (Anexo III). Las alícuotas se tomaron cada 24 h durante 11 días, en cada tratamiento.

5.2.4.4. Determinación de biomasa fúngica fresca, biomasa fúngica seca, proteínas fúngicas, consumo de glucosa, pH y porcentaje de degradación de los hidrocarburos poliarómaticos

El micelio se separó del medio de cultivo mediante filtración al vació utilizando un equipo millipore. Después se hicieron tres lavados con 10 mL de hexano para extraer la fracción del hidrocarburo poliaromático correspondiente, que pudo haber quedado retenido en la membrana y en el micelio. El filtrado de estos lavados se concentró a 10 mL (Fracción 1). Al medio de cultivo de cada unidad experimental se le midió el pH, el consumo de glucosa (Dubois et al., 1956; Anexo III) y se extrajo tres veces con hexano, para obtener al hidrocarburo poliaromático que pudiera haber quedado retenido en el medio de cultivo, luego se concentró a 10 mL (Fracción 2). Ambas fracciones fueron

reunidas, y secadas con Na2SO4 anhidro (adicionado a cada fracción hasta eliminar el

contenido de agua), y se almacenadas en viales de vidrio a -20 °C.

Las fracciones fueron analizadas en un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies® Mod. 6890N) en una columna DB-5, (5%-fenil-metilpolisiloxano) de 60 metros de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y 0.25 µm de espesor de película. La temperatura de inicio fue 70 °C, la cual se mantuvo durante 5 min, posteriormente la temperatura se elevó hasta 280 °C durante 10 min usando una rampa de calentamiento de 40°C/min. El gas acarreador fue helio con un flujo de 1 mL/min, la temperatura del inyector fue de 250 °C, y la inyección fue splitless. Una vez obtenido el cromatograma (Anexo IV), la identificación de cada uno de los picos cromatográficos se llevó a cabo mediante espectrometría de masas empleando un detector de masas (Agilent Technologies® Mod. 5975 inert XL). Los espectros de masas se obtuvieron mediante ionización por impacto electrónico a 70 eV, y para la identificación se compararon los espectros de masas obtenidos para cada compuesto, con una base de datos (HP Chemstation-NIST 05 Mass Spectral Search Program, versión 2.0d).

La biomasa fúngica obtenida después de filtrar cada tratamiento se pesó y después se tomó una fracción de 0.025 g para la determinación de la proteína fúngica por el método de Bradford (Anexo II). La fracción restante se seco en estufa a 40 ± 2 °C por 72 h para determinar el peso seco y posteriormente, se hizo una digestión alcalina que consistió en poner el micelio seco en un vaso de precipitados de 50 mL, adicionado con 10 mL de NaOH 5 N y se dejó por reposar por cinco días (Verdin et al., 2005b). Luego el residuo fue extraido tres veces con 10 mL de hexano (Fracción 3), esta fracción fue secada con Na2SO4 anhidro y después se almacenó en un vial de vidrio a -20 °C para

determinar la cantidad del hidrocarburo poliaromático correspondiente, retenido en el micelio.

5.2.4.5. Determinación de parámetros cinéticos

Con los datos obtenidos de los experimentos anteriores se cálculo el rendimiento en biomasa, es decir, la relación entre el producto obtenido y el sustrato consumido (usualmente fuente de carbono). La ecuación matemática que representa el rendimiento en biomasa es la siguiente:

= − En donde x y s representan la concentración de biomasa y sustrato respectivamente y d indica la diferencial de dichos parámetros.

En la práctica, para el cálcul delo rendim nto se emplea la expresión: ie = − △

△

La velocidad de crecimiento se cálculo considerando que el crecimiento de los hongos filamentosos no es exponencial, de acuerdo con la ecuación de Koch:

/ = / + En donde W y W0 representan la concentracion de biomasa en el tiempo

de evaluación y el tiempo cero respectivamente, mientras que k representa la velocidad de crecimiento y t representa el tiempo de evaluación.

5.2.4.6. Análisis estadístico

El diseño experimental empleado fue completamente al azar, empleando un factorial 2x3 (dos cepas fúngicas y tres hidrocarburos poliaromáticos). Los 6 tratamientos tuvieron tres repeticiones. Los datos obtenidos fueron analizados mediante análisis de

varianza y la prueba de comparación de medias (Tukey, α=0.05) con el programa estadístico SAS.