The Future of Managerial Judging and Procedural Fairness at the ICC

La respuesta del promotor a la acidificación se testó mediante fusiones génicas de tipo transcripcional−traduccional entre el promotor del operón y el gen cat (Fig. 17). El operón fue capaz de incrementar su actividad en respuesta a la acidificación y era por lo tanto responsable principal de los incrementos observados en todos los niveles anteriores: mRNA, proteína y actividad enzimática (Fig. 32). Esto supone un tipo de control a nivel de iniciación de transcripción como indicaba el experimento de "primer extension". Curiosamente, se obtuvieron valores de aproximadamente el doble de actividad cuando la construcción se encontraba en el cromosoma que cuando la construcción estaba presente en un plásmido. Este hecho puede ser interpretado como que la región 5’ al punto de inserción de la construcción estaría afectando a la actividad del promotor.

El hecho de que una mutación en la caja –10 del promotor no impidiera su funcionamiento basal pero sí su capacidad para ser regulado apoya la hípotesis de que esa base puede formar parte de una secuencia de reconocimiento por parte de un factor σ alternativo o de otro tipo de regulador. En E. coli, el factor sigma de fase estacionaria, codificado por el gen rpoS, dirige una respuesta que aumenta la capacidad de resistencia al

ácido, a temperaturas extremas y al estrés osmótico. Curiosamente, la caja −10 del promotor de los genes que regula este factor sigma alternativo, CTATACT, es casi idéntica a la caja –10 del operón del operón atp de S. pneumoniae. Solamente un cambio de base diferencia ambas secuencias (CTACACT en S. pneumoniae) en la posición menos conservada de la secuencia consenso del factor sigma de fase estacionaria de E. coli (45%), mientras que la base en la que el cambio impedía la regulación del promotor en el experimento de las fusiones génicas en S.

pneumoniae era la segunda más conservada (91%) (CTACACT) (Espinosa-Urgel et al., 1996).

Sin embargo, la secuencia promotora mantiene una gran homología con los promotores típicos de S. pneumoniae por lo que aparentemente también puede ser reconocido por el factor sigma típico, algo también postulado para el caso de L. lactis (Koebmann et al., 2000), lo que explicaría la expresión basal detectada a pH alcalino.

5.7

6.2

6.6

7.0

7.3

7.5

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

pH externo

Inc

rementos relati

vos

Tras comparar las secuencias 5’ del operón atp de varias bacterias lácticas relacionadas filogenéticamente con S. pneumoniae, se encontró una secuencia conservada de 8 pb entre las cajas –35 y –10 (Fig. 31). Secuencias similares a la de 8 pb se encuentran en los promotores del operón sat de S. mutans (Gutierrez et al., 1999) y S. pyogenes (GeneBank), y sat de S.

pyogenes (GeneBank) cuya expresión aumenta en condiciones ácidas (Casiano-Colon and

Marquis, 1988). La expresión de estos genes podría estar regulada por un factor específico de pH ácido, de un modo posiblemente independiente de la respuesta común a otros tipos de estrés que utilizan motivos CIRCE en las secuencias promotoras de los genes que codifican chaperonas. Uno de los genes del operón sat, ylxM, posee motivos de unión a DNA de tipo

Figura 32. Resumen de los incrementos observados en actividad ATPasa F0F1, cantidad de

las subunidades α y β, niveles de mRNA específicos del operón atp y actividad del promotor atp en respuesta a la acidificación.

hélice−giro−hélice (Kremer et al., 2001) y podría actuar como regulador de transcripción. De los dos promotores que dirigen la expresión de ylxM, la secuencia de 8 pb sólo se encuentra en el que es inducible por pH. El gen ylxM se transcribe conjuntamente con el gen ffh que codifica una proteína esencial implicada en translocación de proteínas a la membrana y al medio extracelular, similar a la proteína SRP de mamíferos (Valent et al., 1998). Esta proteína ha sido caracterizada recientemente en S. pneumoniae (Zheng et al., 2002). En dobles mutantes ylxM

− ffh se ha observado que no se produce un incremento en la actividad ATPasa a bajo pH (Kremer et al., 2001). Por lo tanto, para aumentar la actividad ATPasa en membrana podría ser necesario el aumento de expresión del operón atp sino también el del gen ffh para exportar el complejo a la membrana (Gutierrez et al., 1999).

La capacidad de adaptación al ácido engloba una respuesta común y otra independiente a otros tipos de estrés. Por lo tanto, la parte específica del estrés ácido podría estar dirigida por un factor sigma alternativo o regulador, siendo uno de los candidatos el producto del gen yxlM, teniendo en cuenta su incremento de expresión, sus motivos de unión al DNA y la hipotética región compartida con otros promotores que se activan con pH ácido lo que apuntaría además a un proceso de autorregulación positiva.

Especie Operón Región promotora Codon de inicio

S. pneumoniae atp TTGACAAATTTAAATTTTAGGACTACACT...35pb...ATG S. oralis atp TTGACAAATTCAAATTTTAGGACTAAACT...35pb...ATG S. sanguis atp TTGACTATTCGATATTTTAGGAGTAAACT...35pb...ATG S. mutans atp TTGACAAACCTGCAAAATAGGACTAAACT...35pb...ATG S. bovis atp TTGACAATTCCTTAAAATAGGACTAAAAT...35pb...ATG S. pyogenes atp TTGACATTCTTAATTTTAAGGAATAGAAT...35pb...ATG L. lactis atp TTGACAAAAACTACGAATAGTAGTAGAAT...53pb...ATG

S. pneumoniae arc TTGACATTACCTAGGAATTGCGTTATAAT...58pb...ATG S. pyogenes arc AAGGAGAGTACACTAGGAACATAAGCA...57pb...ATG

S. pneumoniae sat AATCAAGAGGGACATCCCTTTGCCAGCTAT...114 pb...ATG S. mutans sat TTGCATCTTGGACAAGTAATAAATAAGAAT...110 pb...ATG S. pyogenes sat TATGTTTTAGGTGTTCCCCCTTTTTGACAG...103 pb...ATG

Secuencia Consenso TAGGACTA

La regulación del operón atp parece ser diferente en otros microorganismos evolutivamente más distantes. Recientemente se ha publicado que el incremento de actividad

Figura 33. Comparación de promotores de genes activados en respuesta a pH ácido. Se muestran los promotores del operón atp secuenciados de S. pneumoniae y bacterias genéticamente relacionadas, del operón que codifica el sistema arginino desaminasa (arc) y del operón constituido por los genes yxlM y ffh (sat). Se señalan enmarcadas las posibles cajas −35 y

−10 de los promotores. Se muestra sombreada la secuencia potencialmente implicada en regulación y en negrita las bases conservadas respecto a la secuencia consenso.

ATPasa en S. faecalis se debe principalmente a un incremento en el ensamblaje de las subunidades (Arikado et al., 1999) a pesar de que previamente los mismos investigadores había notificado que existía síntesis proteica de novo (Kobayashi et al., 1984) (Kobayashi et al., 1986). En Saccharomyces cerevisiae hay un incremento de actividad ATPasa en respuesta al ácido, pero no va acompañada de incremento de transcripción, sino de aumento en la capacidad catalítica de la enzima (Eraso et al., 1987). En E. coli, la expresión del operón no está regulada por pH sino por la tasa de crecimiento condicionada por el tipo de fuente de carbono (Kasimoglu et al., 1996).

En S. pneumoniae no se puede descartar completamente que la formación del complejo funcional no dependa también en grado menor de otros factores como el ensamblaje o su capacidad para insertarse en membrana. Sin embargo, no parece que el control a nivel de ensamblaje sea importante en S. pneumoniae si se tiene en cuenta que en S. bovis, una bacteria cuya ATPasa F0F1 sigue aparentemente una regulación similar, la cantidad de

subunidad β en el citoplasma es mucho menor que la que se encuentra en membrana (Miwa et

al., 2001).