Future Work 93

NS5B del VHC.

Todos los productos amplificados fueron purificados mediante filtración en membrana con el kit PCR clean-up NucleoFast 96 PCR (Marcherey-Nagel, Alemania), tal y como se ha descrito anteriormente en el apartado 3.6.

Gracias a la estrategia de amplificación utilizada en este trabajo, mediante el método explicado anteriormente en el apartado 3.3 y 3.4, se obtuvo la secuencia completa bidireccional de ambas regiones, la proteasa NS3 y polimerasa NS5B en 60 muestras de pacientes infectados con VHC.

Las secuencias sentido y antisentido, obtenidas para cada porción génica fueron analizados con el paquete Stadenv2.0, como se ha descrito anteriormente en el apartado 3.8. Con los cromatogramas editados se construyó una base de datos Staden (Gap4) para cada aislado, y región del virus obteniendo finalmente del ensamblaje un total de 120 secuencias consenso (60 para el gen NS3 y 60 para el gen NS5B del VHC). Para el ensamblaje se utilizó como secuencia de referencia el aislado HPCJCG del VHC genotipo 1b (D90208), extraída de la base de datos GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Las secuencias consenso de nucleótidos de la región NS3 en formato fasta de 60 aislados de pacientes fueron alineadas usando el programa BioEditv7.1.3 (Hall 1999), a la secuencia de referencia prototipo para el subtipo 1b: el aislado Con1 (AJ238799) y se tradujeron las secuencias de nucleótidos (Figura 1 Anexo VIII) a aminoácidos del dominio proteasa (aa 1- 180) en busca de polimorfismos relacionados con mutaciones de resistencia conocida para la proteasa NS3 (Figura 2 Anexo IX).

Para la polimerasa NS5B, se procedió de la misma manera. Las secuencias consenso de nucleótidos en formato fasta de 60 aisaldos de pacientes fueron alineadas usando el programa BioEditv7.1.3 (Hall 1999), a la secuencia de referencia prototipo para el subtipo 1b: el aislado Con1 (AJ238799) y se tradujeron las secuencias de nucleótidos a aminoácidos (aa 1- 591) en busca de polimorfismos relacionados con mutaciones de resistencia conocida para el gen NS5B (Figuras 3 y 4 Anexo X).

4.6 Determinación de la frecuencia de mutaciones de resistencia a nuevos

antivirales

4.6.1 Mutaciones de resistencia a inhibidores de la proteasa NS3

En primer lugar se realizó una revisión bibliográfica sobre las sustituciones en la proteasa NS3 del VHC asociadas a resistencia a inhibidores de la proteasa (IP) in vitro e in vivo. Las sustituciones asociadas con resistencia a IP descritas en la literatura y consideradas en este trabajo se especifican en la tabla 11.

Mutación Identificación Referencia

C16S in vitro Yang 2008

in vivo no publicado V36A/M/L/G/I/C

in vitro Sheaffer 2004, Lin 2004, Sarrazin 2007,Tong 2008, Zhou 2008

in vivo Sarrazin 2007, Ralston 2007, Kieffer 2007,Tong 2008, Bartels 2008; 2013, Barbotte 2010, Kieffer 2012, Sullivan 2013

A39V in vitro Yang 2008

in vivo no publicado

Q41R/K/P/H in vitro Sheaffer 2004, Tong 2008, Liverton 2010

in vivo Vermehren 2012

F43S/C/Y/V/I/L in vitro Tong 2008, Liverton 2010

in vivo Vermehren 2012, Kwong 2011 T54A/S/V/G/C

in vitro Sheaffer 2004, Zeuzem 2005, Tong 2006, Sarrazin 2007

in vivo Sarrazin 2007, Curry 2008,Tong 2008, Susser 2009, Gaudieri 2009, Bae 2010, Kwong 2011, Kieffer 2012, Bartels 2013

V55A/F/I/K/T in vitro Susser 2008, Qiu 2009

in vivo Susser 2009, Vermehren 2012, Paolucci 2012, Bartels 2013

D79E in vitro Thibeault 2004

in vivo no publicado

Q80K/R/L/N/H/G in vitro Lenz 2010

in vivo Bae 2010, Paolucci 2012, McPhee 2012, Bartels 2013

A87T in vitro Susser 2009

in vivo Besse 2012,Susser 2012

Y105C in vitro McPhee 2012

in vivo no publicado

R109K in vitro Yi 2006

in vivo Bartels 2008

R117H in vitro Susser 2009

in vivo Besse 2012,Susser 2012

S122G/A/R/N/T in vitro Tong 2006, McPhee 2012

in vivo McPhee 2012, Tong 2014

R123T in vitro Lin 2004, Tong 2006

in vivo no publicado

S138T/D/P in vitro Seiwert 2006; 2007, Imhof 2011

in vivo Besse 2012

Mutación Identificación Referencia

R155G/K/T/M/I/L/ S/Q/P/N/W

in vitro Lu 2004, Lin 2004, Zhou 2007, Sarrazin 2007, Lagacé 2012

in vivo Sarrazin 2007; 2010, Kieffer 2007, Bartels 2008; 2013, Susser 2009, Colson 2008

A156F/N/S/T/V/G/ D

in vitro Sheaffer 2004, Lu 2004, Lin 2004; 2005, Tong 2006, Sarrazin 2007, He 2008

in vivo Sarrazin 2007, Kieffer 2007, Hiraga 2011

V158I/M in vitro Qiu 2009, Flint 2009, Kieffer 2007

in vivo Kwo 2010, Bartels 2013

V163L in vitro Taremi 1998, Qiu 2009

in vivo no publicado D168Q/A/Y/V/E/T/

N/P/I/H/G/F/S/K

in vitro Lin 2004, Sheaffer 2004, Lu 2004, Seiwert 2007, He 2008, Koev 2007, Lagacé 2012

in vivo Bae 2010, Zeuzem 2012, Vermehren 2012, Bartels 2013

V170A/T/G/L/M in vitro Zeuzem 2005,Tong 2006

in vivo Curry 2008, Bartels 2008; 2013 Susser 2009, Besse 2012

E173G in vitro McPhee 2012

in vivo no publicado

S174F/P in vitro Imhof 2011

in vivo Besse 2012, Susser 2012

M175L in vitro Romano 2010

in vivo Paolucci 2012, Barnard 2013, Bartels 2013

E176G in vitro Krieger 2001, Abe 2007, Flint 2009

in vivo no publicado

Tabla 11 (continuación). Posiciones asociadas a mutaciones de resistencias a IP.

Para obtener una localización espacial, se utilizó la estructura tridimensional de la proteasa NS3 del aislado prototipo BK del VHC genotipo 1b (PDB 1CU1). Mediante el programa PyMol v1.1 se representaron con esferas los residuos aminoacídicos relacionados en la literatura con resistencia a los IP (Figura 35). Como se puede observar, se han descrito mutaciones de resistencia tanto en el sitio activo, como en zonas distantes.

En segundo lugar se realizó un alineamiento con las secuencias de aa de la proteasa NS3 del VHC de los 60 aislados estudiados, con respecto a la secuencia de referencia del aislado Con1, subtipo 1b. En la figura 36 se muestra el alineamiento de la proteasa NS3 de los aislados respecto al aislado de referencia, sólo en aquellas posiciones de aminoácido asociadas a mutaciones de resistencia a IP.

Figura 35. Posición de los aminoácidos relacionados con resistencia a IP descritas en la literatura. Las esferas en colores representan los residuos de aminoácidos afectados por las

diferentes variaciones que se indican con las flechas.

De todas las variaciones que confieren resistencia a IP, en los aislados del VHC-1b estudiados en este trabajo se encontraron con una frecuencia del 1,67% (1/60 de las secuencias analizadas) las variaciones: V36L asociada a resistencia a TPV, BOC y VPV; V55A asociada a resistencia a TPV, BOC, SOV, PHX1766; A87T y R117H asociadas a resistencia a TPV y BOC;

S122G asociada a resistencia a SMV; y V170T asociada a resistencia a TPV,

BOC, NLV, FDV, SMV y DNV. Además se encontraron las variaciones

S122T y S122N con una frecuencia del 5% (3/60 de las secuencias analizadas)

Figura 36. Presencia de variaciones asociadas a resistencia a IP en aislados del VHC de 60 pacientes. La primera secuencia corresponde al aislado prototipo Con1 (VHC-1b). Los

puntos indican identidad con el prototipo. Los colores empleados en la tabla se corresponden con la naturaleza del aminoácido y de la cadena lateral: rojo para aminoácidos polares con carga positiva; negro para polares con carga negativa; azul para aminoácidos con cadenas laterales polares pero sin carga; verde para los aminoácidos con cadenas laterales hidrofóbicas y granate para cisteína, naranja para glicina y gris para prolina.

NS3

Posiciones aa Fármaco* _{Aislamientos (%)} Resistencias/ Observaciones

V36A/M/L/G/I/C

TPVAP/BOCAP/SMVAP/VPVI

II

/DNVIII/ABT-450III/ASVIII/

VDVII/NLVII/PHX1766†

V36L 1/60(1,67%)

A39V _GS-9132NS4A NINGÚNA _{A39S 1/60 (1,67%)}

V55A/F/I/K/T

TPVAP/BOCAP/VPVIII/DNVII

I

/ABT-450III/ SOVII/

PHX1766†

V55A 1/60 (1,67%)

D79E TPVAP/BOCAP NINGÚNA D79H 1/60 (1,67%)

A87T TPVAP/BOCAP A87T 1/60 (1,67%) A87S 1/60 (1,67%)_{A87V 1/60 (1,67%)}

Y105C ASVIII NINGÚNA Y105F 1/60 (1,67%)

R117H TPVAP/BOCAP R117H 1/60 (1,67%) R117C 1/60 (1,67%) S122G/A/R/N/T SMVAP S122T 3/60 (5%) S122N 3/60 (5%) S122G 1/60 (1,67%) V170A/T/G/L/M TPVAP/BOCAP/SMVAP/FDV†

/DNVIII/ASVIII/NLVII/SCH5

67312I/PHX1766†

V170T 1/60 (1,67%) V170I 21/60 (35%)