A General Coupling Cost Function

La citometría de flujo es una técnica que se basa en la utilización de un láser para efectuar el recuento y la clasificación de las células según sus características morfológicas y/o en presencia de marcadores, como el ioduro de propidio (IP).

El IP es un agente intercalante de las moléculas de ADN, siendo también una molécula fluorescente que se utiliza como fluorocromo para teñir las células. El citómetro posteriormente cuantifica la intensidad de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de fluorocromo, y este a su vez a la cantidad de ADN en la célula.

El IP no puede atravesar las membranas celulares, por lo que para la técnica empleada en este caso, se permeabilizó previamente la membrana, utilizando un detergente, para permitir la tinción no solo de los fragmentos, sino también del ADN de las células en los distintos estadíos del ciclo celular.

Brevemente, el ciclo celular consta de 4 fases en las que el contenido de ADN de cada célula varía. En este caso utilizamos células humanas, diploides (con número doble de cromosomas (2n)), derivadas de cáncer de próstata. El contenido de ADN en estas células se dice que es 2c, debido a que tiene el doble de contenido de ADN que las gametas, durante el ciclo celular, este valor de 2c se duplica hasta llegar a 4c. Mediante un histograma, en el que se grafica contenido de ADN en función de la cantidad de células o fragmentos, se

pueden observar la poblaciones en las distintas fases celulares (Esquema 2).

• Fase G1: Ocurre el crecimiento celular acompañado de la síntesis de proteínas y ARN. En cuanto a la carga genética, es 2n 2c. Existe dentro de esta fase, un estado G0, especial de reposo en el que las células no se disponen a dividirse y por lo tanto, no sintetizan proteínas. Tanto la fase G0 como la G1 tienen el mismo contenido de ADN, por lo tanto, se observan juntas en el histograma como el pico principal en condiciones normales.

• Fase S: Se produce la replicación o síntesis de ADN, donde cada cromosoma se duplica y queda formado por dos cromátidas idénticas. En el histograma es una región donde la célula tiene contenido de ADN variable entre 2n 2c y 2n 4c.

• Fase G2: Se continúa con la síntesis de proteínas y ARN. La carga genética es 2n 4c ya que se ha duplicado el material genético.

• Fase M: Ocurre la división celular, se divide en dos células hijas idénticas, cada una con carga genética 2n 2c. La fase G2 junto con la fase M se observa en el histograma como un pico con contenido de ADN igual a 2n 4c. Dentro del histograma, la presencia de un pico sub G1 es indicativo de contenido de ADN menor a 2c, es decir, fragmentos. Por lo general, la necrosis genera pequeñas fracciones celulares y de ADN, mientras que en la apoptosis, al ser una muerte celular programada y con un mayor orden, los fragmentos suelen ser de un mayor tamaño. Este método, utilizando solamente ioduro de propidio en células permeabilizadas permite, luego de descartar los fragmentos

ADN de tamaño muy pequeño, sugerir la apoptosis mientras que una tinción conjunta con Anexina V permitiría su confirmación.

Esquema 2. Fases del ciclo celular con su contenido de ADN e histograma tipo observado por

citometría de flujo con tinción de IP.

Se realizó el ensayo de ciclo celular para los mismos compuestos y líneas celulares que en el ensayo de MTT. Se testeó el efecto del Cand, Tlm,

Irb y los complejos CuCand, CuIrb, CuTlm y de la sal CuCl2.2H2O en

concentraciones de 50 μM en las líneas LNCaP, PC3 y DU145.

La concentración de trabajo (50 μM) se seleccionó en base a la

viabilidad observada en el ensayo de MTT. A esta concentración no se observa una gran disminución de la viabilidad celular por lo que, si se desea estudiar la manera en que los compuestos afectan el ciclo celular, en principio es necesario que la célula esté en condiciones metabólicas activas.

Por acción de los compuestos puede ocurrir que la célula se detenga en alguna de las fases del ciclo, sin poder continuar con el proceso de división. Esto proceso es conocido como arresto del ciclo celular y se observaría como una variación en la relación del tamaño de los picos del histograma.

En nuestro caso, no se observó para ninguno de los compuestos

testeados arresto celular para una concentración de 50 μM (no mostrados).

Dentro de los cambios que se ven respecto a un histograma normal es la aparición, en algunos casos, de un aumento en la población en la región sub- G1 y que es indicativo de muerte celular.

En particular, en este tipo de aumento de la población en la región sub-

G1 se observa para el caso del CuTlm en la línea celular LNCaP (Fig. 5) el

porcentaje de la población en esta región es de un 12,1 % para el complejo, y difiere significativamente con los valores para Tlm (3,8 %) y para el Cu (4,5 %) (valores obtenidos por promedio de 3 ensayos diferentes). Por otro lado, para las líneas PC3 y DU145 no se observa la aparición de un pico en la región sub- G1 para ninguno de los compuestos testeados.

Figura 5. Histograma para células LNCaP teñidas con ioduro de propidio sin tratamiento (Control) y luego de 24 hs de tratamiento con 50 μM de CuCl2.2H2O (Cu(II)), Tlm, CuTlm. Los

fragmentos de ADN de bajo peso molecular fueron excluidos del histograma. Al menos 10000 eventos fueron colectados.

A partir de los histogramas obtenidos por citometría de flujo, al igual que para el caso del CuTlm se calculó mediante un software el porcentaje de

población en cada estadío con respecto al total. En la figura 6 se muestra el

porcentaje de células en un estadío sub-G1 para todos los compuestos en las tres líneas celulares. En este gráfico se puede observar que las líneas DU145 y PC3 no muestran un aumento significativo de la población en la región sub-G1 con respecto al control, mientas que en la línea celular LNCaP, este porcentaje es mayor en relación a las otras líneas, esto puede deberse a que las LNCaP es una línea celular andrógeno dependiente, en un estadío inicial del cáncer y por lo tanto pueden ser más sensibles al tratamiento con los distintos compuestos. Dentro de esta línea celular, se observa que el CuTlm provoca el mayor aumento de la población sub-G1 de los compuestos testeados, el CuCand también aumenta con respecto al control. Sin embargo, no muestra diferencias significativas con respecto al Cand.

Por otra parte, si se observa este ensayo de ciclo celular en conjunto con el ensayo de MTT descripto anteriormente, para la línea celular LNCaP a 50

μM, se puede ver que para el caso del CuTlm que la disminución de la

actividad metabólica, según el ensayo de MTT, se corresponde con un aumento en la muerte celular. Para este complejo en particular, se propone un mecanismo de muerte celular programada o apoptosis, que se sugiere a partir del tamaño de los fragmentos de ADN en la región sub-G1. Al igual que para el CuTlm, el CuCand muestra una disminución de la actividad metabólica en MTT, acompañado de un aumento de la población sub-G1, aunque en menor medida que el complejo anterior.

Si bien para CuIrb se observa disminución de viabilidad celular a 100

μM, los ensayos de citometría de flujo se realizaron a una concentración donde

no se observa un marcado efecto antitumoral (50 μM) y por eso no se alcanza

Control Cu(II) CuCand Cand IrbCu Irb TlmCu Tlm 0 2 4 6 8 10 12 14 % p obla c ión su b-G 1 LNCaP PC3 DU145

*

Figura 6. Porcentaje de la población en la región sub-G1 para los compuestos testeados con

una concentración de 50 μM, en las tres líneas celulares de cáncer de próstata: LNCaP (negro), PC3 (rojo) y DU145 (azul). *Diferencias significativas con respecto al ligando (p <0,05).