General setting

Un estudio reciente había demostrado que la movilidad gliding depende del T4P en tres cepas aisladas de patologías humanas, para las cuales se conoce la secuencia nucleotídica genómica (Varga, J. J. et al., 2006). La movilidad tipo gliding dependiente del T4P constituye un importante comportamiento bacteriano también conocido como twitching (Henrichsen, J., 1972; McBride, M., 2001; Harshey, R., 2003). Teniendo en cuenta que en el estudio referido (Varga, J. J. et al., 2006) solo se analizaron cepas de tres aislados humanos, cuando existen una gran diversidad de C. perfringens causantes de diversas infecciones en humanos y animales (gangrena gaseosa, intoxicaciones alimentarias, diarrea asociada al uso de antibióticos y diarrea esporádica), se consideró importante y relevante evaluar si la movilidad del tipo gliding es una propiedad intrínseca y general de los aislados salvajes de C. perfringens. Para ello se realizaron análisis de movilidad gliding de 17 cepas derivadas de patologías humanas y animales causadas por C. perfringens, incluidas aquellas cepas previamente analizadas en el trabajo publicado antes mencionado (Varga, J. J. et al., 2006; Tabla 2, Sección 3.1.). En nuestro estudio la movilidad es definida como la habilidad de las células de diseminarse a partir del punto de inoculación en al menos 4 mm después de 72 h de incubación a 37°C. Bajo estas condiciones se estudió primeramente el gliding de la Cepa 13, SM101 y NCTC8239; las dos primeras cepas analizadas previamente (Varga, J. J. et al., 2006) y NCTC8239 (intoxicaciones alimentarias, al igual que SM101) cuyas capacidades de movilidad sobre superficies no eran conocidas. Primeramente se trató de reproducir la movilidad reportada por Varga, J. J. y colaboradores. Alícuotas de cultivos de estas tres cepas se colocaron en placas de agar 0,7 % de distintos medios de cultivo comúnmente usados para la propagación de C. perfringens (Sección 3.2.). Cuando las bacterias

89 fueron colocadas en placas de BHIA o TYA estas fueron capaz de desplazarse a partir del punto de inoculación de forma similar a la reportada (Varga, J. J. et al., 2006), mostrando un patrón de desplazamiento distintivo. Interesantemente, cuando la Cepa 13, SM101 y NCTC8239 fueron inoculadas en los medios BHIGA y TGYA (los cuales contienen glucosa al 2 %) éstas fueron incapaces de moverse a partir del sitio de siembra, indicando que el gliding fue inhibido. Además, cabe destacar que el grado de movilidad fue más evidente en TYA que en BHIA el cual había sido empleado en el trabajo publicado (Varga, J. J. et al., 2006) (Figura 15 y dato no mostrado). Por lo tanto, se decidió que todos los experimentos de movilidad se realizarán usando placas de TYA o TYA suplementado con azúcar.

Cuando los ensayos de movilidad gliding fueron realizados sobre la colección completa de aislados de C. perfringens (Tabla 2, Sección 3.1.), todas las cepas presentaron la capacidad de moverse a partir del sitio de inoculación mediante una movilidad del tipo gliding en placas de TYA. Contrariamente el gliding fue completamente inhibido en presencia de glucosa 2 % (Figura 16 y dato no mostrado). Por lo tanto, teniendo en cuenta que la glucosa es un inhibidor conocido de otros comportamientos sociales bacterianos, tal como esporulación (Philippe, V. A. et al., 2006; Raju, D. et al., 2006), formación de biofilms (Stanley, N. R. et al., 2003) y movilidad (Shrout, J. D. et al., 2006) se concluyó que la glucosa adicionada al BHIA y al TYA, dando BHIGA y TGYA, respectivamente, fue responsable del efecto represivo de las movilidades tipo gliding de todas las cepas de C. perfringens analizadas.

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Figura 15: La glucosa reprime la movilidad gliding de C. perfringens. Fenotipos de movilidad

gliding de tres cepas de C. perfringens patógenas humanas, Cepa 13, SM101 y NCTC8239. El

gliding se desarrolló después de la incubación de una gota de 5 l de un cultivo concentrado en fase logarímica media de crecimiento de cada cepa sobre los medios BHIA o TYA con o sin suplementación con glucosa 2 % (Sección 3.4.). Todas las fotos fueron tomadas después de 72 h de incubación anaeróbica a 37°C. BHIA y TYA medios sin glucosa; BHIGA y TGYA, medio suplementado con glucosa 2 %. Los círculos punteados negros muestran los diámetros de los puntos de inoculación iniciales.

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Figura 16: La glucosa reprime la movilidad gliding de distintas cepas de C. perfringens aisladas de diferentes patologías y hospedadores. Fenotipos de gliding de una colección de cepas de C. perfringens patogénas de humanos y animales: 1, NB16 (diarrea asociada al uso antibióticos); 2, JGS1818 (diarrea en cerdos); 3, 294442 (diarrea en perros); 4, NCTC10239 (intoxicación alimenticia); 5, 317206 (diarrea en perros); 6, AHT327 (diarrea en caballos); 7, B11 (diarrea asociada al uso antibióticos); 8, B41 (diarrea asociada al uso antibióticos); 9, F5603 (diarrea esporádica); 10, F4969 (diarrea esporádica); y 11, AHT2911 (diarrea en caballos). Ver Tabla 2, Sección 3.1. para más detalle.

92 Para determinar cómo la movilidad del tipo gliding es afectada por diferentes niveles de glucosa, un gardiente de glucosa fue generado en una placa de TYA (Sección 3.4.1.). Se inocularon 5 l de un cultivo concentrado de la cepa contamínante de alimentos SM101 en diferentes posiciones distribuídas a lo largo del gradiente de concentración de glucosa generado en la placa. Se utilizó esta cepa debido a que el gliding desarrollado por ésta no es muy extenso y permite hacer inoculaciones paralelas seguidas y adyacentes en placa de Petri. Como se observa en la Figura 17, la extención del gliding mostrado por esta cepa patógena de humanos fue inversamente proporcional a la concentración de glucosa; cuando la concentración de glucosa disminuye se incrementa la movilidad gliding a partir del punto de siembra.

Figura 17: Efecto represivo dosis respuesta de la glucosa (Glu) sobre la capacidad de movilidad gliding de C. perfringens. Efecto de gradiente de glucosa sobre la movilidad gliding de la cepa enterotoxigénica cpe+ contamínante de alimentos SM101 (Tabla 2). Un tercio de una placa TYA se cortó y se reemplazó con TGYA fundido, el cual contiene 2% de glucosa. Después de la solidificación del TGYA adicionado, se generó un gradiente natural de glucosa (como se muestra de izquierda a derecha) debido a la difusión de moléculas de glucosa desde la sección de TGYA (la cual contiene 2% de glucosa adicionada) hacia la porción de TYA de la placa (la cual no contiene glucosa adicionada) (Sección 3.4.1.). Toda las fotos fueron tomadas a las 72 h de incubación de las placas en condiciones anaeróbicas a 37°C.

93 Para establecer la concentración mínima de glucosa requerida para inhibir la movilidad gliding, cinco concentraciones de glucosa fueron independientemente ensayadas: 0,1 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % y 2 %. Las cepas usadas para este estudio de inhibición del gliding dosis respuesta fueron la Cepa 13 y NCTC8239. La Cepa 13 de C. perfringens es un aislado natural que es capaz de causar gangrene gaseosa experimental, puede ser manipulada genéticamente, la secuencia de su genoma está completa y publicada, y es ampliamente utilizada como cepa de referencia de C. perfringens para estudios de investigación alrededor del mundo (Shimizu, T. et al., 2002; Shimizu, T., Yaguchi, H. et al., 2002; Ohtani, K. et al., 2002). Por lo cual es importante determinar como su movilidad es afectada por distintas concentraciones de glucosa. La cepa NCTC8239 se usó en paralelo debido a la gran extención del gliding que realiza en superficie, lo que permitiría ver modificaciones sutilis dependientes de la adición de glucosa sobre el desplazamiento en placa. Como se muestra en la Figura 18, a una concentración de glucosa del 1 %, no se observa movilidad del tipo gliding tanto en la cepa productora de la gangrena gaseosa Cepa 13, como en la cepa aislada de intoxicaciones alimentarias NCTC8239. En contraste, estas dos cepas son capaces de desplazarse escasmente mediante gliding en placas de TYA suplementadas con 0,5 % de glucosa. Cuando las placas de TYA fueron suplementadas con 0,25 % y 0,1 % no se observó inhibición del gliding (Figura 18). Por lo tanto, la represión de la movilidad social tipo gliding en C. perfingens causante de la patología necrótica de tejido, gangrena gaseosa, es concentración dependiente y se hace efectiva a una concentración de glucosa del 0,5 %.

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Figura 18: Evaluación de la concentración mínima de glucosa requerida para inhibir el desarrollo del gliding de C. perfringens. Las cepas utilizadas fueron NCTC8239 y Cepa 13, productora de intoxicaciones alimentarias y gangrena gaseosa, respectivamente. Las cepas fueron crecidas en placas de TYA y TYA suplementado con concentraciones crecientes de glucosa (Glu) como se indica. Toda las fotos fueron tomadas a las 72 h de incubación de las placas en condiciones anaeróbicas a 37°C.

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4.2.

perfringens.

Para tratar de establecer si el efecto inhibitorio observado de la glucosa sobre la movilidad gliding es un fenómeno general de regulación catabólica por carbono (represión), se ensayaron otros carbohidratos rápidamente metabolizables, tal como galactosa, fructosa, lactosa y sacarosa. El gliding de la Cepa 13 (gangrena gaseosa) y de la cepa NCTC8239 (contaminante de alimentos, gliding extenso) fue inhibido cuando se crecieron en placas con 2 % de fructosa, galactosa, lactosa, o sacarosa (Figura 19). La Cepa 13 muestra un gliding insipiente con galactosa 2 % (Figura 19, izquierda). A continuación se analizó el efecto sobre la movilidad tipo gliding de carbohidratos más complejos, como ser rafinosa y almidón, los cuales son lentamente metabolizables. Estos dos carbohidratos son necesarios para una eficiente esporulación de C. perfringens y para la producción de la enterotoxina CPE (C. perfringens enterotoxin). Cuando se adiciona 2 % de rafinosa a las placas de TYA no se observa inhibición de la movilidad gliding (Figura 19). Con 2 % de almidón, la extensión del desplazamiento de ambas cepas se vio disminuída pero no inhibida, aunque a una concetración de almidón del 0,4 % (concentración comúnmente usada en medios de esporulación de C. perfringens; Sacks, L. E., 1983) el gliding no se vió afectado (Figura 19). Cuando este ensayo fue realizado con el resto de las cepas de C. perfringens provenientes de disitintos aislados, listadas en la Tabla 2, Sección 3.1., no ser observó movilidad gliding para ninguna de todas las cepas testeadas cuando fueron crecidas en placas de TYA suplementadas con 2 % de fructosa, galactosa, lactosa, o sacarosa; mientras que el gliding no fue afectado cuando se suplementó con 2 % de rafinosa. Sin embargo, en placas de TYA suplementadas con 2 % de almidón, todas las cepas analizadas fueron no móviles sobre la superficie del agar, con la exepción de las cepas NCTC10239 (intoxicaciones alimentarias), la cual excibió una movilidad gliding parcial, y JGS1807 (diarrea en cerdos) la cual fue altamente móvil aún en presencia de almidón 2 % (datos no mostrados).

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Figura 19: Efecto de carbohidratos simples y complejos sobre la movilidad gliding de C. perfringens. Carbohidratos rápidamente metabolizables (Fru, fructosa; Gal, galactosa; Lac, lactosa; Sac, sacarosa) y carbohidratos complejos (Raf, rafinosa; Alm, almidón), comúnmente usados para incrementar la esporulación y producción de CPE en cepas de C. perfringens, fueron ensayados por su habilidad de afectar la movilidad gliding. Se muestran los fenotipos de gliding de la Cepa 13 productora de gangrena gaseosa y la cepa NCTC8239 contaminante de alimentos. Las fotos fueron tomadas después de 96 h de incubación anaeróbica a 37°C sobre placas de TYA suplementadas con los distintos carbohidratos según se indica.

97 Los resultados generales indican que los carbohidratos complejos rafinosa y almidón no afectan la movilidad tipo gliding a concentraciones rutinariamente usadas (2 % y 0,4 %, respectivamente) para la formación de esporas y producción de CPE en C.