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A pesar de que CPT1C prácticamente no tiene actividad carnitina palmitoiltransfersa demostrada hasta el momento, CPT1C posee los aminoácidos característicos de la unión de los sustratos palmitoil-CoA y carnitina conservados, asimismo mantiene la misma afinidad por el el inhibidor malonil-CoA que el resto de isoformas CPT1. Además, aunque no se ha descrito el mecanismo todavía, CPT1C modula los niveles intracelulares de ceramidas (Carrasco et al., 2012, Gao et al., 2011; Ramírez et al., 2013). Todos estos metabolitos son compuestos lipídicos, lo cual nos permite hipotetizar que CPT1C está involucrada en el metabolismo lipídico celular. Asimismo, los estudios realizados in vivo en este trabajo y en otros anteriores,

hay un aumento en la concentración plasmática de grasas, como es durante el ayuno y la alimentación de dietas ricas en grasa.

A continuación se muestran los resultados obtenidos de la validación de la línea celular GT1-7 como sistema modelo para el estudio de la privación de nutrientes y la sobrecarga lipídica en células hipotalámicas in vitro, así como algunos datos preliminares sobre el papel de CPT1C en los mecanismos que intervienen en la adaptación metabólica a estas dos situaciones.

4.1. VALIDACIÓN DEL MODELO CELULAR GT1-7

La validación de la línea celular GT1-7 como modelo celular adecuado para desarrollar nuestro objetivo, se basó en la comprobación que CPT1C modula su expresión en función de las concentraciones de nutrientes del medio, del mismo modo que lo hace in vivo en el MBH en respuesta al ayuno (ver figura 52). Las células GT1-7 fueron privadas de suero o bien de glucosa durante dos horas, y se analizó la expresión de CPT1C por western blot. La figura 66A muestra como CPT1C responde al déficit nutricional aumentando su expresión. También se muestran los niveles de LC3I y II como marcadores de activación de la autofagia, ya que se ha descrito que ésta se induce por privación de suero y no de glucosa, corroborando la adecuada respuesta de las células GT1-7 a ambos tratamientos (figura 66A).

Por otro lado, debido a la mayor sensibilidad de los ratones CPT1C KO a la obesidad inducida por la dieta, junto con la idea de que los ácidos grasos saturados causan lipotoxicidad a nivel celular, se ensayó la respuesta de CPT1C en células GT1-7 bajo el tratamiento con palmitato. Para ello, se consideró conveniente analizar el efecto producido a corto y a largo plazo, ya que puede haber respuestas diferenciales dependiendo tanto de la dosis como del tiempo de tratamiento. En base a estudios previos, se fijó la dosis de palmitato a 300 µM, mientras que se fijaron los tiempos a 6 y 24 horas de tratamiento. La figura 66B, muestra en primer lugar que CPT1C en situación basal, aumenta su expresión a lo largo del experimento, conforme va aumentando la confluencia y las conexiones intercelulares. También se puede ver como a corto plazo, el palmitato induce levemente la expresión de CPT1C, la cual disminuye considerablemente después de 24 horas de tratamiento, indicando que en este período posiblemente el palmitato esté causando lipotoxicidad celular. En conjunto, estos resultados demuestran que CPT1C en las células GT1-7 responde a variaciones nutricionales, mostrando una inducción adaptativa de su expresión frente a la privación de nutrientes y a una carga de

palmitato.

Figura 66. Expresión de CPT1C en respuesta a distintos tratamientos nutricionales. Imágenes de

western blot representativas de A) Expresión de CPT1C y LC3 en situación basal o bajo privación de

suero y glucosa durante 2 horas, B) expresión de CPT1C bajo tratamiento con palmitato a 6 y 24 horas.

4.2. RESPUESTA DE CPT1C Y OTROS MARCADORES METABÓLICOS AL AYUNO IN VITRO

Una vez validado el modelo celular, se diseñó el siguiente experimento con el fin de caracterizar con más detalle la respuesta de CPT1C frente a una situación de ayuno in vitro. Datos de nuestro grupo, indican que la expresión de CPT1C aumenta con la privación de suero a largo plazo, por lo que se decidió mantener el medio celular suplementado con 10% de suero en todas las condiciones para evitar fluctuaciones en la expresión de CPT1C. Otros estudios realizados en esta línea celular en los que privan a las células de nutrientes también mantienen el suero al 10% (Beall et al., 2012; Taib et al., 2013). Las células control se mantuvieron en medio completo a lo largo del experimento, mientras que las células en condición de ayuno, tal y como se ha descrito en la literatura (Kaushik et al., 2011), se trataron con medio con la misma composición que el control pero sin glucosa y suplementado con oleato 300 µM. La expresión de CPT1C, así como de sensores energéticos y de marcadores de estrés reticular fueron analizados a las 2, 6 y 24 horas de tratamiento.

El perfil de expresión de CPT1C se caracteriza por mostrar un aumento a tiempos cortos (hasta las 6 horas) que decae a las 24 horas. Con el fin de conocer el contexto metabólico celular, se analizaron los sensores energéticos AMPK y mTOR. Tal y como está descrito, AMPK muestra una activación temprana, la cual no es sostenida y a las 6 horas ya ha desaparecido, mientras que la inhibición de mTOR no ocurre hasta tiempos largos de

Control - Suero - Glucosa

CPT1C LC3

Control Palmitato Control Palmitato

CPT1C

6 horas 24 horas

B. A.

un pico de activación a las 6 horas que se mantiene más levemente a las 24 horas. Estos datos apuntan a que CPT1C presenta un perfil de expresión similar al de los marcadores de estrés de retículo en las condiciones ensayadas.

Figura 67. Marcadores metabólicos y de estrés reticular en respuesta al ayuno in vitro. Niveles de

expresión de CPT1C, fosfo-AMPK, fosfo-mTOR, mTOR, fosfo-IRE y fosfo-EIf2 en respuesta al ayuno en células GT1-7 durante 2, 6 y 24 horas de tratamiento. Los resultados se expresan como el promedio ± SEM respecto los controles de cada tiempo. n = 2.

4.3. RESPUESTA DE CPT1C Y DE MARCADORES DE ESTRÉS RETICULAR A PALMITATO

A continuación se realizó otro experimento con el fin de analizar la respuesta de CPT1C y los marcadores de estrés reticular pIRE y peIF2, frente a una carga de palmitato en condiciones normales de glucosa. Las células control se trataron con medio completo, mientras que el resto fueron tratadas con medio completo suplementado con palmitato 300 µM durante 30 minutos, 2, 6 y 24 horas. Las tres proteínas analizadas muestran un patrón de expresión muy parecido a lo largo del time-course. CPT1C y peIF2 incrementan a los 30 minutos hasta las 2 horas, disminuyendo claramente a partir de las 6 horas de tratamiento. La

CPT1C peIF2 pmTOR pAMPK mTOR pIRE Actina

Ctrl - Glu +Ol Ctrl - Glu +Ol Ctrl - Glu +Ol

2h 6h 24h 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 N iv e l d e p ro te ín a (U .A .) Ayuno 2h 6h 24h * * *

disminuido considerablemente. Teniendo en consideración que está bien establecido que el palmitato causa estrés de retículo endoplasmático en una amplia gama de tipos celulares. Estos resultados indican que CPT1C es sensible a las concentraciones intracelulares de palmitato y que responde a éste de forma parecida a los marcadores de estrés reticular analizados.

Figura 68. Expresión de CPT1C y marcadores de estrés reticular en respuesta a palmitato. Western blot

de CPT1C, fosfo-eIF2 y fosfo-IRE en células GT1-7 en respuesta a palmitato 300 µM durante 30 minutos, 2, 6 y 24 horas. Los resultados se expresan como el promedio ± SEM respecto los controles de cada tiempo. n = 1-2.