Hidden Markov Model with Expectation Maximization

Durante el proceso de PCR a tiempo real el programa SDS 2.1 nos proporcionó una gráfica en la que veíamos cómo el producto de cada uno de los pocillos iba creciendo en cantidad a medida que pasaban los ciclos (Figura 12).

Figura 12

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La línea verde que aparece en la gráfica de amplificación nos muestra el curso de amplificación de una muestra. El eje X muestra el número de ciclo y el eje Y muestra la fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto en cada momento de la reacción.

La gráfica muestra tres fases: una primera fase en la que la fluorescencia presenta valores no detectables a pesar de que el producto se está acumulando exponencialmente (ciclos del 1 al 18); una segunda fase de tipo exponencial en la que la cantidad de producto que hay en un ciclo crece hasta casi el doble en el siguiente ciclo (ciclos del 18 al 28); y una última fase conocida como fase de meseta en la que los reactivos que participan en la reacción se han ido consumiendo y alguno de ellos se encuentra en cantidades limitantes dando lugar a un enlentecimiento de la reacción y a un aumento menor del producto en cada ciclo (ciclos del 28 al 40).

El ciclo en el que la fluorescencia comienza a ser detectable se conoce como ciclo umbral o ciclo CT. El ciclo umbral de la reacción viene determinado

por la cantidad de muestra inicial añadida al pocillo. Si la cantidad de muestra añadida es elevada se alcanzará antes el ciclo en el que la fluorescencia es detectable; en este caso el número de ciclos necesarios será bajo. Por el contrario, si la cantidad inicial de la muestra añadida al pocillo es baja, el número de ciclos necesarios para acumular una cantidad de producto suficiente para que la fluorescencia sea detectada será mayor, por lo que el ciclo umbral tardará más en alcanzarse. Por tanto, para conocer la cantidad de muestra de la que partimos es necesario conocer el valor CT y, por este motivo, el cálculo

del valor CT debe hacerse de forma cuidadosa con el fin de no introducir ningún

tipo de error que pudiera llevarnos a unos resultados finales erróneos.

Existen unas condiciones que la PCR en tiempo real debe de cumplir para ser óptima. En primer lugar, la curva estándar construida a partir de diferentes diluciones de la muestra que nos darán diferentes valores de CT debe de tener

un coeficiente de determinación (R2_{) de 0,980. Además, se considerará que}

una reacción de PCR a tiempo real es óptima cuando la cantidad de producto de un ciclo de amplificación a otro casi se duplica, dando lugar a una eficiencia de amplificación de entre el 90-105%. Una eficiencia de alrededor de 100% nos indica que nuestro experimento es sólido y reproducible.

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Una vez conocida esta información, para el análisis de los resultados obtenidos, debemos de tener en cuenta que nosotros realizaremos una cuantificación relativa normalizada, mediante un gen de referencia que se basa en el cociente resultante de la cantidad relativa del ácido nucleico diana para cantidades equivalentes de muestras y controles estudiados. Para ello, incluimos en la reacción un control endógeno que nos permite asegurarnos de que los resultados obtenidos para el gen diana son comparables ya que, las cantidades de muestra de las que hemos partido son equivalentes y con ello se evita la necesidad de una cuidada cuantificación y carga de la muestra inicial.

Para hacer este tipo de análisis hay que elegir una de las muestras como muestra calibradora. Generalmente la muestra calibradora es aquella que se cree que no ha sufrido alteración en la expresión del gen por la circunstancia estudiada, por ejemplo por una enfermedad. La muestra calibradora es tomada como referencia para calcular si el resto de muestras han aumentado o disminuido su expresión del gen.

Una vez se han tenido en cuenta estas condiciones se toman los valores de CT de la gráfica de cada muestra y de su control endógeno. Para el análisis

de los resultados se pueden utilizar 3 métodos:

1. Método 2-C_{T (Livak)}

Este método asume que tanto el gen diana como el gen endógeno se han amplificado con una eficiencia del 100% y con una diferencia entre ellos de menos del 5%, aunque estos datos hay que confirmarlos mediante los métodos adecuados. Tras este paso, debemos de normalizar el valor CT de las muestras

y del gen endógeno para las muestras y para la muestra calibradora de la siguiente forma:

CT(muestra) = CT (gen estudiado) – CT (gen endógeno)

CT(calibrador) = CT (gen calibrador) – CT (endógeno calibrador)

Como segundo paso se normaliza el CT de la muestra estudiada frente

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CT = CT (muestra) – CT (calibrador)

Y finalmente se calcula la ratio de expresión:

2–CT _{= ratio de expresión normalizada}

El resultado obtenido son las veces que se aumenta o disminuye la expresión del gen estudiado en la muestra estudiada con respecto a la muestra calibradora que está normalizada, gracias al uso del gen endógeno que permite eliminar cualquier diferencia generada por distinta cantidad de muestra.

2. Método CT usando un gen de referencia

Corresponde a una variación del método Livak, que utiliza las diferencias existentes entre los valores de CT del gen endógeno y el gen de referencia para

cada muestra. Aquí el valor de expresión de la muestra calibradora no es uno, sino que los valores de expresión obtenidos en este método para las muestras son divididos por los valores de expresión elegidos para la muestra calibradora, obteniéndose como resultado de este cálculo exactamente lo mismo que se obtenía del método 2-CT.

Ratio (reference/target) = 2 CT(reference) – CT(target)

3. Método de Pfaffl

El método 2–CT _{es sólo válido cuando la eficiencia de amplificación para}

el gen estudiado y el gen endógeno es similar. En otros casos la fórmula que debe de utilizarse para el cálculo de la diferencia de expresión es:

(Expresión del gen estudiado)CT, gen estudiado (calibrador –gen estudiado)

Expresión =--- (Expresión del gen endógeno)CT, gen endógeno (calibrador – gen estudiado )

En esta ecuación la expresión del gen estudiado y del gen endógeno se refiere a la eficiencia de amplificación de ambos genes. CT, gen estudiado

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(calibrador – gen estudiado) se refiere al valor obtenido para CT en el gen

estudiado para la muestra calibradora menos el valor obtenido para CT en el

gen estudiado para la muestra que estamos analizando. CT, gen endógeno (calibrador – gen estudiado) se refiere al valor obtenido para CT en el gen

endógeno para la muestra calibradora menos al valor obtenido para CT en el

gen estudiado para la muestra que estamos analizando. La ecuación asume que cada gen tiene la misma eficiencia de amplificación en las muestras de estudio y en calibradora, no teniendo que ser necesario que esto se cumpla cuando hablamos del gen de estudio y el de referencia.

Finalmente indicar que el método 2-CT y el método de Pfaffl están muy relacionados ya que el primero no es más que un caso especial del método de Pfaffl.