History and the 2009 Survey

Uno de los principales efectos de la aplicación de tratamientos térmicos de alta temperatura es la reducción del ataque de patógenos (Woolf, 1995; Paul, 1990; Lurie, 1998). No obstante, los mecanismos responsables del control de patógenos en los frutos tratados no están totalmente elucidados y el tipo de respuesta encontrada depende del producto analizado y de las condiciones de tratamiento utilizadas (Lurie, 1998). Se ha informado la existencia de un efecto directo del calor en la reducción de la viabilidad de los hongos, así como en la capacidad de infección. Fallik y col. (1996c) encontraron que los TAT reducen la patogenicidad de Penicillum expansum en manzanas al reducir la germinación de esporas.

Resulta de interés destacar que cuando los frutos se inocularon luego del tratamiento también se observó una reducción en la infección, sugiriendo la presencia de compuestos inhibitorios o mecanismos activos de defensa que podrían contribuir a reducir el ataque de patógenos. Similares resultados se observaron en peras, donde la la incidencia de Mucor y Phialophora fue reducida mediante la aplicación de TAT. incluso cuando los frutos fueron inoculados luego del tratamiento térmico (Spotts y Chen, 1987). Los mecanismos indirectos de resistencia contra patógenos involucran una serie de interacciones complejas con diferentes líneas de respuesta, como la presencia de barreras mecánicas a los microorganismos, la presencia de compuestos antimicrobianos y la existencia de proteínas capaces de tolerar las condiciones de estrés o de inhibir la colonización de los tejidos por los patógenos (Couey, 1989). Algunas de estas respuestas son constitutivas, mientras que otras son inducidas por diferentes factores. La aplicación de TAT incrementa la resistencia de frutos en algunas casos al inducir a la enzima PAL y con ello la biosíntesis de lignina y compuestos fenólicos. También se ha mencionado la obstrucción de rajaduras a nivel superficial de los frutos debido a la fusión y redistribución homogénea de las ceras superficiales (Roy y col., 1994) como consecuencia de la aplicación de TAT. Este efecto fue hallado en diferente frutos tratados térmicamente, tales como pomelo (Rodov y col., 1996), mandarina (Schirra y D’hallewin, 1997), pimientos (Fallik y col., 1996b) y melones (Fallik y col., 2000). En otros casos se ha encontrado un incremento en los niveles de compuestos antimicrobianos. Estudios en cítricos mostraron que los TAT promueven la síntesis de la fitoalexina escoparona en las células cercanas a heridas luego de 12-24 h del tratamiento (Kim y col., 1991). Otros estudios mostraron que los TAT incrementan la actividad de proteínas asociadas a defensa como quitinasas, glucanasas y peroxidasas (Schirra y col., 2000; Lurie, 1997). Estos resultados demuestran la existencia de respuestas comunes entre el estrés por alta temperatura y el provocado por patógenos. Por otra parte, también se ha descrito la existencia de respuestas comunes frente al estrés térmico y al estrés oxidativo, aunque no se ha analizado en detalle en frutos (Larkindale y Knight, 2002; Dat y col., 1998). La inducción de HSP, que es una respuesta común de los organismos luego de la exposición a las altas temperaturas (Nover, 1991), puede ser inducida por estrés oxidativo (Liu y Thiele, 1996; Me Dufee y col., 1997). Del mismo modo, el estrés térmico puede inducir la expresión de genes involucrados en la defensa contra el

incremento de las ERO y el daño oxidativo puede presentarse comúnmente durante la postcosecha como consecuencia del ataque de patógenos, estrés por bajas temperaturas, deficiencia de agua y nutrientes y advenimiento de la senescencia.

El objetivo del presente capítulo es analizar si la reducción en la incidencia de enfermedades de postcosecha provocada por los TAT en frutillas se asocia con efectos directos del calor sobre la viabilidad y patogenicidad de los hongos o si existen respuestas mediadas por el fruto (asociadas con el metabolismo fenólico u oxidativo) que puedan estar involucradas en el proceso.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. E fe c to d ire c to d e lo s tra ta m ie n to s

2 .1 .1 . V ia b ilid a d d e b a c te ria s y h o n g o s

Se cosecharon frutillas {Fragaria x ananassa cv Selva) con 75% de color superficial rojo y se trasladaron inmediatamente al laboratorio. Se seleccionaron frutos sin presencia de defectos o deterioro, se colocaron en bandejas plásticas y se cubrieron con PVC (15 fim de espesor). Luego se trataron a 45°C por 3 h. Finalizado el tratamiento las bandejas se almacenaron a 0°C por 0 , 7 y 14 d y luego se

transfirieron a 20°C por 2 d. Se tomaron dos muestras de 5 frutos para cada tiempo de almacenamiento y tratamiento analizado. Cinco frutos, pesando aproximadamente 50 g se agitaron en agua estéril por 45 min. A partir de la suspensión resultante, se prepararon dos series de diluciones desde 1 0 " 1 hasta 1 0 ' 5 y 1 mi de cada dilución se

sembró en medios de cultivo apropiados (placas Petrifilm™ 6400 y 6407, 3M, St. Paul, MN, USA) por triplicado. Las placas para el recuento de bacterias mesófilas se incubaron a 30°C por 2 d y las correspondientes al recuento de hongos a 20°C por 5 d.

Los recuentos se descartaron cuando se encontraron menos de 30 o más de 300 colonias. Los resultados se expresaron como unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de fruto. El experimento se repitió dos veces en el caso de hongos y tres en el caso de bacterias. Dado que la misma tendencia se observó en todas las experiencias, sólo se muestran los resultados de la primera.

2.7.2. V e lo c id a d d e g e rm in a c ió n de c o n id io s

Alícuotas de suspensiones conidiales de Botrytis cinérea y Rhizopus stolonifer obtenidas de cepas aisladas en el IIB-INTECH (INTECH 377/00-F18 e INTECH 364/00-F8, respectivamente) se sembraron en agar papa glucosado y luego se incubaron las placas en la oscuridad a 20°C por 12 d. Las placas se colocaron en estufa a 45°C por 3 h. Un grupo de placas no se trató térmicamente y fue utilizado como control. Los conidios se suspendieron en Tween-20 0,03% y la suspensión se filtró a través de tela. Utilizando un hemocitómetro para realizar los recuentos se prepararon diluciones de la suspensión y se ajustó la concentración a 2 x 1 0 5 conidios

El porcentaje de germinación se estimó contando 100 esporas al azar en un microscopio (400 x). Un conidio se consideró germinado cuando la longitud del tubo germinativo fue igual o superior a la del conidio. Cada conteo se realizó por triplicado y la experiencia completa se realizó por duplicado. Los resultados se expresaron como porcentaje de conidios germinados.

2.2. E fe c to de tr a ta m ie n to s té rm ic o s s o b r e e l m e ta b o lis m o fe n o l ic o

2 .2 .1 . F e n o le s to ta le s

Se cosecharon frutos 75% rojos y se trataron térmicamente (45°C, 3h). Luego se almacenaron a 20°C por 2 d. Se cortaron dos discos (5 mm de espesor) de la zona ecuatorial de cada fruto y se dividieron en 2 zonas (externa e interna). La zona externa fue obtenida separando el tercio externo mientras que los dos tercios restantes fueron considerados como zona interna. Se tomaron muestras luego del tratamiento y luego de 1 y 2 d a 20°C; y las mismas se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron

a -20°C hasta su uso. Aproximadamente 1 g de fruto congelado se procesó en 6 mi de

etanol. La mezcla se homogeneizó y centrifugó a 9.000 x g por 10 min a 4°C. Tres mililitros del sobrenadante resultante se llevaron a 100 mi con agua. Los extractos se utilizaron para la determinación de fenoles totales. Doscientos microlitros de extracto se adicionaron a 1,1 mi de agua y 200 \ú de reactivo Folin-Ciocalteau. Luego de 3 min a 25°C se adicionaron 1,5 mi de solución saturada de Na2C 03 y la mezcla de reacción

se incubó por 1 h a la misma temperatura. Se prepararon dos extractos para cada tratamiento, zona y tiempo de almacenamiento analizado y las determinaciones se realizaron por triplicado. Se midió la absorbancia a 760 nm y se calculó el contenido de compuestos fenólicos utilizando fenol como estándar. El contenido de fenoles totales se expresó como g de fenol por kg de fruto.

2.2.2. A c tiv id a d e s e n z im á tic a s

Para la evaluación de la actividad de enzimas vinculadas con el metabolismo fenólico se cosecharon frutos 75% rojos y se trataron térmicamente (45°C, 3h). Luego se almacenaron a 20°C por 2 d. Se tomaron muestras finalizado el tratamiento y luego

de 6 , 1 2 y 24 h en el caso de polifenol oxidasa (PPO) y peroxidasa (POD), y luego de

0, 12, 24 y 48 h en el caso de fenilalanina amonio-liasa (PAL). Las mismas se procesaron inmediatamente o se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -2 0 °C hasta su uso.

2 .2 .2 .1 . A c tiv id a d fe n ila la n in a a m o n io lia s a (P A L )

Aproximadamente 5 g de tejido fresco se homogeneizaron por 2 min en un Omnimixer con 20 mi de buffer Na2B4 0 7.1 0H2 0 0I1 M, mercaptoetanol 50 mM, EDTA 2

mM, polivinilpolipirrolidona (PVPP) 30 g I"1, pH 8 ,8. La suspensión se centrifugó a

10.000 x g por 10 min y el sobrenadante se utilizó para ensayar la actividad PAL. La mezcla de reacción se preparó del siguiente modo: buffer Na2B4O7.10H2O 0,03 M, L-

fenilalanina 0,01 M y 1 mi de extracto enzimático en un volumen final de 3 mi. La mezcla se incubó a 30°C y la actividad se determinó espectrofotométricamente a 290 nm a través de la producción de ácido trans-cinámico. Los resultados se expresaron como el cambio en la densidad óptica (ADO) en una hora bajo las condiciones del ensayo, por gramo de fruto. Se prepararon dos extractos para cada tratamiento y tiempo de almacenamiento analizado y las determinaciones se realizaron por duplicado.

2.2.2.2. A c tiv id a d p ir o g a lo l p e ro x id a s a (P O P )

Aproximadamente 5 g de tejido fresco se homogeneizaron por 2 min en un Omnimixer con 20 mi de buffer Na2HP04 0,02 M, NaH2P 04 0,03 M, PVPP 1 0 g I'1,

PMSF 1mM, Tritón X 100 0,1% v/v, NaCI 1 M, pH 7,0. La suspensión se centrifugó a

1 0 . 0 0 0 x g por 1 0 min y el sobrenadante se utilizó para ensayar la actividad pirogalol

peroxidasa. La mezcla de reacción se preparó del siguiente modo: buffer fosfato 50 mM pH 6,5, H202 8 mM, pirogalol 45 mM y 300 \ú de extracto en un volumen total de 3

mi. La mezcla se incubó a 30°C y la actividad se determinó espectrofotométricamente - a 430 nm. Los resultados se expresaron como el cambio en la densidad óptica (ADO) en una hora bajo las condiciones del ensayo, por gramo de fruto. Se prepararon dos extractos para cada tratamiento y tiempo de almacenamiento analizado y las determinaciones se realizaron por duplicado.

2.2.2.3. A c tiv id a d p o life n o l o x id a s a (P P O )

Aproximadamente 5 g de tejido congelado se homogeneizaron por 2 min en un Omnimixer con 20 mi de buffer (Na2H P 04 0,02 M, NaH2P 04 0,08 M, PVPP 30 g I 1,

PMSF 1mM, Tritón X 100 0,1% v/v, NaCI 1 M, pH 6,0). La suspensión se centrifugó a

1 0 . 0 0 0 x g por 1 0 min y el sobrenadante se utilizó para ensayar la actividad polifenol

Los resultados se expresaron como el cambio en la densidad óptica (ADO) en una hora bajo las condiciones del ensayo, por gramo de fruto. Se prepararon dos extractos para cada tratamiento y tiempo de almacenamiento analizado y las determinaciones se realizaron por duplicado.

2 .2 .3 . C o n te n id o d e á c id o s a lic ílic o (A S )

El contenido de AS se determinó en frutos controles y tratados térmicamente (45°C, 3h), luego de la cosecha y por un período de 15 h de almacenamiento a 20°C. Se procesaron cinco gramos de frutos congelados con 10 mi de etanol 90% en un Omnimixer y el extracto obtenido se centrifugó a 10.000 x g por 15 min. El tratamiento de las muestras se realizó de acuerdo a Scott y Yamamoto (1994). Finalmente las muestras se resuspendieron en 500 pl de buffer fosfato 100 mM pH 7,0, se filtraron a través de membranas de 0,22 pm y se inyectaron (20 mbar por 25 segundos) en un equipo de electroforesis capilar Hewlett Packard (Agilent Technologies, Inc. CA, USA), equipado con un capilar de sílica fundida de 25 mM de diámetro interno (Thermal Separations, USA). Los capilares fueron acondicionados por lavados sucesivos con HCI 1M, NaOH 1M y agua. Las corridas fueron registradas mediante un detector de arreglo de diodos UV-visible (190-600 nm), realizándose finalmente la detección a 280 nm. Las determinaciones se realizaron a 20°C en buffer K2HPO4-KH2PO4 100 mM

pH 7,0 y el voltaje utilizado fue de 25 kV. Se utilizaron muestras de AS como patrón. Se prepararon dos extractos independientes para cada tratamiento y tiempo analizado y las determinaciones se realizaron por duplicado. Los resultados se expresaron como contenido de AS respecto al valor inicial.

2.3. E fe c to de tr a ta m ie n to s té rm ic o s s o b r e e l d e te rio ro y a s p e c to s v in c u la d o s a l