Homogenous (average) Pass-through Estimates

técnicas estandarizadas de laboratorio.

En esta sección de la fase II, luego de haber realizado el escalamiento descrito en la fase I, se procedió a diluir la biomasa hasta obtener una densidad celular aproximada de 2x106 para un volumen de 7200 mL, dicho volumen fue distribuido en fiolas de vidrio con capacidad de 500 mL para los tratamiento de 0,25%, 0% y

1% de gasoil por volumen de biomasa, realizando triplicados de cada uno (excepto la DQO y los HCT que se realizaron por duplicado), este proceso se ejecutó de la siguiente manera (Tabla 3.11):

Tabla 3.11 Diseño experimental de biorremoción de gasoil por parte del consorcio microalgal. Tratamiento Monitoreo (300 mL /c.u) DQO (300 mL /c.u) HTC (200mL /c.u) Control (0% de gasoil) 0,25% de gasoil 0,50% de gasoil 1% de gasoil

DERECHOS RESERVADOS

El periodo de duración del ensayo comprendió un intervalo de 30 días en los cuales, los cultivos se mantuvieron en un fotoperiodo luz: oscuridad 12:12 h a 4klux, con agitación manual diaria y temperatura de 30 ± 2° C.

A continuación, se describe el procedimiento para: recuentos celulares, determinación de pigmentos (clorofila total y carotenoides totales), carbohidratos totales, lípidos totales, proteínas totales y cuantificación de bacterias asociadas, dichos indicadores fueron monitoreados cada 3 días hasta la culminación del ensayo.

3.5.2.1 Crecimiento microalgal (densidad celular).

El crecimiento celular fue contabilizado mediante la evaluación de densidad celular por medio de la cámara de Neubauer, este procedimiento esta descrito en la fase I, dicho reconteo se realizó cada tres días para conocer el efecto de la fracción de gasoil en el comportamiento de la curva de crecimiento del consorcio.

3.5.2.2 Bacterias asociadas.

Para realizar el conteo de las bacterias asociadas al consorcio microalgal, se procedió a efectuar un análisis bacteriológico (Romo, 2002) para cada replica de cada uno de los tratamientos (0,25%, 0,5% y 1% de gasoil) y el control en el inicio (to), mitad (tm) y final (tf) del ensayo. Se utilizaron los siguientes materiales y equipos:

Tubos de ensayo Placas de Petri

Varilla de vidrio Matraz

Agar-Agar: 16 g/mL Caldo nutritivo: 8 g/mL Solución salina: 9 g NaCl/mL

Agua destilada: dependiendo del número de placas y tubos

• Procedimiento:

1. Para preparar el agar se sigue el mismo procedimiento del sembrado en medo sólido, cambiando el algal por el caldo nutritivo (8 g/mL).

2. Igualmente para el llenado de placas se sigue el mismo procedimiento de preparación de placas descrito en el sembrado en medio sólido descrito en la fase I.

3. Marcar placas.

4. Añadir 9mL de solución salina a los tubos de ensayo. 5. Esterilizar tubos con solución salina.

6. Marcar tubos.

7. Se hacen diluciones de 10 hasta 10 ", es decir, al tubo 1 se le añade 1 mL del cultivo, de este tubo se toma 1 mL el cual, se añade al tubo 2 y así sucesivamente hasta llegar al tubo 6 (figura 3.2).

8. Del último tubo se va a tomar 0,1 mL que será añadido cuidadosamente con la ayuda de la micropipeta (recordar usar puntillas estériles).

9. El volumen añadido será distribuido en la placa con ayuda de una varilla de vidrio estéril doblada en un ángulo de 90°C (mojada en alcohol y luego pasada por el mechero, esperando a que se enfrié), mientras se gira con la mano simultáneamente, hasta que se absorba completamente el inóculo. 10. Las placas sembradas se colocan en la incubadora por 24-48 horas, a 30º

C en condiciones de aerobiosis.

11. Trascurrido el tiempo se procede al conteo de las colonias, con ayuda de un contador mecánico.

12. Se seleccionan las placas donde haya entre 30 y 300 colonias y se estima el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL).

13. De ser incontable la placa perteneciente al último tubo de dilución se procederá a añadir un tubo más y por consiguiente una placa más al análisis.

Figura 3.2 Diluciones seriadas del cultivo para el análisis bacteriológico (Tortora, 2007).

3.5.2.2 Producción de pigmentos.

El contenido de clorofila total (clorofila a + clorofila b) y carotenoides totales fue determinado para todos los casos a partir de cultivos frescos de cada réplica de

los diferentes tratamientos. Los pigmentos se extrajeron de la siguiente manera según el método descrito por Marker, Nusch, Rai y Riemann (1980):

1. Se tomó un 1 mL de la muestra y se dispensó en un tubo Eppendorff de 1,9 mL de capacidad, las muestras fueron centrifugadas a 8000 rpm durante 15 minutos.

2. El sobrenadante se descartó con la ayuda de una pipeta Pasteur de cuello largo y al pellet se le añadió 1 mL de metanol al 95% (esta etapa se realizó bajo poca luz, para evitar la oxidación de la clorofila).

3. Luego se centrifugó (centrifugadora marca Zelian, modelo oleun 2) por 10 minutos y se añadieron en tubos de vidrio para proceder a la lectura en el espectofotómetro de 2,5 mL de capacidad ajustando el volumen con metanol al 95%.

4. En estos tubos se midieron a través de un espectofotómetro (marca MILTON-ROY, modelo 21D) las absorbancias (D.O.) de cada una de las muestras a 480 nm para carotenoides, 665 nm para clorofila a y 649 para la clorofila b.

3.5.2.3 Composición bioquímica.

a. Determinación de carbohidratos totales.

El análisis de carbohidratos totales se basó en el método fenol-sulfúrico propuesto por Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers y Smith (1956) y modificado por Kochert (1978).

1. Se tomaron 2 mL de la muestra para ser congeladas a -20ºC y luego se le adicionó 3mL de NaOH (1 mL cada vez), luego se resuspendió y se repartió en tres tubos de ensayo (1mL en cada tubo).

2. Se le adicionó luego 25 mL de fenol al 80% con agitación constante y 2,5 mL de H2SO4 concentrado, y se mezcló en un agitador vortex (marca Ika, modelo genius 3).

3. A temperatura ambiente se dejaron enfriar las muestras por un lapso de 30 min. para luego medir la absorbancia a 484 nm contra blanco antes de 2 h en el espectrofotómetro.

4. Luego se realizó una curva patrón bajo la mezcla de una disolución de glucosa 1 mg/mL en hidróxido de sodio al 1N con 9 mL de NaOH 1N (dilución 1:10) y a partir de esta disolución se realizó la curva patrón.

Tabla 3.12 Curva patrón expresada en µg/ µL

µL Glucosa 0 200 400 600 800 1000

µL NaOH 1000 800 600 400 200 0

b. Determinación de lípidos totales.

Los lípidos totales de la biomasa se analizaron según el método de carbonización simple descrito por Marsh y Weinstein (1966). El procedimiento de extracción de lípidos se realizó de acuerdo al método de Bligh y Dyer (1959), donde se procedió con lo siguiente:

1. La biomasa se trató con 4,5 mL de cloroformo - metanol (1:2 v/v) y se mantuvo a 4 ºC durante 24 h para ayudar a la extracción.

2. Los tubos se centrifugaron a 3000 r.p.m. durante 10 min. Para separar el sobrenadante del pellet de restos celulares. A las muestras se les adicionó 1,5 mL de cloroformo y 1,5 mL de agua destilada para luego ser agitadas vigorosamente en el agitador vórtex.

3. La fase acuosa (superior) se extrajo con una pipeta Pasteur para descartarse. Se secó mediante la evaporación (en una estufa marca Alca) del cloroformo a 37 °C el extracto lipídico obtenid o. Posteriormente, las muestras se resuspendieron en 1 ó 2 mL de cloroformo según su concentración lipídica y fueron distribuidas por triplicado en alícuotas de 50 a 200 µL para evaporarse de nuevo.

4. Para la curva patrón se preparó una solución de 0,3 mg mL-1 de tripalmitina en cloroformo, a partir de la cual se utilizaron alícuotas de 0,1 hasta 0,9 mL. 5. Luego de evaporarse y enfriarse todas las muestras, patrón y blanco, que sólo contiene cloroformo, se les añadió 2 mL de ácido sulfúrico concentrado y se colocaron en la estufa a 200 °C durante 15 min y así carbonizar el extracto lipídico.

6. Los tubos se enfriaron a 4 °C, para luego ser ma ntenidas a temperatura ambiente durante 10 min. Se les añadió seguidamente 3 mL de agua destilada y se colocaron de nuevo en la nevera hasta que todas las burbujas desaparecieron.

7. Las muestras se midieron a 375 nm en un espectofotómetro contra el blanco de ácido sulfúrico. A esta longitud de onda la relación entre la absorbancia y la concentración de lípidos es lineal para todas las clases de lípidos analizados (Marsh y Weinstein 1966).

Los valores de lectura de la curva patrón de tripalmitina se utilizaron para el cálculo de la recta mediante un ajuste lineal por mínimos cuadrados y determinados por interpolación. La concentración de lípidos totales es expresada en µg/mL y pg/cel y corresponden al promedio de todas las réplicas.

Tabla 3.13 Curva patrón Volumen (µL) [mg mL-1] 100 0,03 200 0,06 300 0,09 400 0,12 500 0,15 600 0,18 700 0,21 800 0,24 900 0,27

c. Determinación de proteínas totales

El análisis de proteínas totales se basó en el método propuesto por Lowry, Rosenbrough, Farr y Randall (1951) y con modificaciones realizadas por Herbert, Phipps y Stronoe (1971). Los reactivos a utilizar se muestran a continuación:

1. Na2CO3 al 5% (si es Na2CO3.1H2O sería al 13,4%) Debe prepararse con agua destilada previamente hervida y se puede almacenar a temperatura ambiente.

2. Tartrato de sodio-potasio al 1% en CuSO4.5H2O al 0,5%. Esta dilución precipita en pocas horas, así que se debe centrifugar y usar el sobrenadante limpio y claro. Se puede almacenar a temperatura ambiente. 3. Mezcla de 50 mL del reactivo 1 con 2 mL del reactivo 2. Se debe preparar

antes del análisis. No almacenar.

4. Dilución del reactivo Folin-Ciocalteau con agua destilada en una proporción 1:1. Preparar antes del análisis. No almacenar.

5. Solución de BSA a un 1 mg/mL en NaOH 1M 6. NaOH 1M

Tabla 3.14 Curva patrón (mg/ µL).

µL BSA 0 (Blanco) 25 50 75 100

µL NaOH 600 575 550 525 500

µL H2O 400 400 400 400 400

• Procedimiento:

1. Agregar a 2 mL de biomasa fresca o congelada 2 mL de NaOH 1M. 2. Poner las muestras en baño de maría 95-100 ºC por 1 hora.

3. Dejar enfriar a temperatura ambiente. 4. Centrifugar 10 minutos a 4000 rpm.

5. Transferir 100 µL del sobrenadante a un tubo de ensayo (por triplicado) (Este valor puede aumentar o disminuir dependiendo de la cantidad de proteína presente en la muestra, de manera que el valor de absorbancia que se obtenga entre en la curva patrón.

6. Añadir 400 µL de agua destilada, 500 µL de NaOH 1M y agitar en el vortex (la cantidad de agua destilada podrá variar, dependiendo del volumen de sobrenadante que se haya utilizado en el paso anterior)

7. Añadir 2 mL del reactivo 3, tanto a las muestras a analizar como a la curva patrón y al blanco, agitar para homogenizar.

8. Después de 10 minutos, añadir 400 µL del reactivo 4 y agitar inmediatamente.

9. Dejar en reposo 30 minutos a temperatura ambiente y leer a 750 nm. 10. La curva debe ser ajustada a la ecuación de una curva de primer grado. 11. Recuerde tomar en cuenta cualquier dilución realizada para el cálculo de la

concentración de proteínas de la muestra final.

3.5.3 Fases III: Cuantificación del porcentaje de remoción de hidrocarburos