4.3 Interview findings
4.3.5 How do users react to existing anti-phishing methods?
KAT2.
Para llevar a cabo este análisis se utilizó el patógeno biotrofo Pseudomonas
syringae pv tomato (Pst) DC3000 tanto en un contexto de interacción compatible (IC) como
de interacción incompatible (II) donde la cepa lleva el plásmido de avirulencia avrRpm1. En ambos casos, se analizó la respuesta originada en las hojas infiltradas (respuesta local) como la respuesta en las hojas adyacentes (respuesta sistémica) hasta las 72 horas
posteriores a la infección. Como se muestra en los análisis Northern blot de la figura 25.A, la expresión del gen KAT2 aumentó en respuesta a la infección con P. syringae con una cinética de inducción distinta según el tipo de cepa utilizada. Concretamente, la cepa virulenta Pst. DC3000 desencadenó la activación transcripcional de KAT2 llegando al máximo de expresión a las 24 horas, similar al patrón observado para el marcador patogénico PR1 tanto en las hojas infiltradas como en las hojas adyacentes no inoculadas. Se ha descrito que la defensa dependiente de genes R (II) es más rápida en el tiempo y más intensa en la inducción de genes (Tao et al., 2003). Concordantemente, la expresión de
KAT2 en respuesta a la cepa avirulenta DC3000 avrRpm1 (II) fue más rápida y más intensa
que la observada durante la IC, observándose en este caso el máximo de expresión a partir de las 8 horas y manteniendo niveles inducidos hasta las 72 horas postinfección. Estos resultados indican que KAT2 es un gen inducible por patógenos biotrofos con un patrón de inducción similar al mostrado por genes típicos de defensa frente a patógenos (Ward et al., 1991; Lawton et al., 1996), en los cuales la activación es más rápida e intensa en respuesta a un patógeno avirulento y precede a la activación de PR1, similar al patrón observado en
KAT2. Sin embargo, el gen KAT2 no altera su expresión en respuesta a la aplicación de SA
(figura 14 y 25.C), y por lo tanto, otra molécula señalizadora debe estar implicada en la activación transcripcional de este gen. El H2O2 y otras ROS incrementan sus niveles endógenos en respuesta a una gran variedad de factores de estrés bióticos y abióticos, principalmente en infección con patógenos (Apel et al., 2004; Torres y Dangl, 2005; Torres et al., 2007). Aunque las ROS se producen en respuesta a todo tipo de patógenos, es en presencia de patógenos avirulentos cuando tiene lugar una producción masiva de ROS que es mantenida en el tiempo (Torres et al., 2005). De hecho, durante la II, el H2O2 se ha descrito como un regulador de los procesos de muerte celular asociados a la HR (Lamb y Dixon, 1997; Bolwell, 1999; Mittler et al., 1999; Grant y Loake, 2000; Greenberg y Tao, 2004). Con el fin de comprobar si el H2O2 podría ser la molécula implicada en la activación de KAT2 en respuesta a P. syringae (al menos en la II), se analizó la expresión del gen en respuesta al tratamiento exógeno con este compuesto. El análisis Northen blot realizado mostró una inducción de KAT2 aproximadamente a partir de las 2 horas tras el tratamiento manteniendo niveles elevados hasta las 24 horas (figura 25.B). Este resultado sugiere que el H2O2 podría ser parte de la señalización que activa a KAT2 en respuesta a Pseudomonas.
A
0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 L Col S 16C 12G 38D Pst. DC3000 L S L S L S PR1 rRNA t.d.i (h) 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 0 8 24 48 72 L Col S PR1 rRNA 16C 12G 38D Pst. DC3000 (AvrRpm1) L S L S L S t.d.i (h)B
C
KAT2 rRNA 0 0,5 2 24 t.d.t. (h) H2O2 KAT2e PR1 rRNA 0 3 6 24 0 3 6 24 0 3 6 24 0 3 6 24 Col 16C 12G 38D SA t.d.t (h)Figura 25. Nivel de expresión de los genes KAT2 y PR1, marcador de las respuestas a patógenos biotrofos dependientes de SA, en plantas Col y líneas transgénicas KAT2as inoculadas con
Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 y DC3000 (avrRpm1) o tratadas exógenamente con
SA.
Nivel de expresión de KAT2 en respuesta a H2O2.
La expresión de los genes se analizó por Northern blot empleando sondas radiactivas específicas para cada gen. La sonda KAT2e corresponde a un fragmento de 241 pb de la región 3´ no codificante del mRNA que no está presente en el transgén y por tanto solo hibrida con el transcrito endógeno. Se incluye la tinción del rRNA con bromuro de etidio como control de carga. Las líneas 16C, 12G y 38D corresponden a las tres líneas transgénicas homocigotas KAT2as seleccionadas. A. La mitad de las hojas de roseta de plantas adultas cultivadas en tierra durante dos meses en fotoperiodo de DC, fueron infiltradas mediante jeringa con una solución 5·107 u.f.c./ml de Pst. DC3000 (avrRpm1) y 104
u.f.c./ml de Pst DC3000. Se recogieron muestras a distintos tiempos después de la inoculación (t.d.i.) tanto de hojas infiltradas (L) como de hojas adyacentes no inoculadas (S). B-C. Plántulas de 11 días cultivadas en medio líquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v) se trataron con H2O2 5 mM (B) o con SA
250 µM (C) y las muestras se recogieron a distintos tiempos después de realizar el tratamiento (t.d.t.).
Las plantas que acumulan bajos niveles de SA en respuesta a patógenos o mutantes afectados en las vías de señalización mediadas por SA presentan una menor resistencia a patógenos virulentos y avirulentos (Gaffney et al., 1993; Delaney et al., 1994; Glazebrook et al., 1996; Nawrath y Métraux, 1999; Dewdney et al., 2000). El análisis de la expresión del gen PR1 en las plantas transgénicas KAT2as en respuesta a Pseudomonas podría revelar una posible función de KAT2 en la resistencia mediada por SA contra este patógeno. Esta función podría estar relacionada tanto con su posible papel en la síntesis de SA como con eventos de señalización y transducción de SA. Para discriminar entre ambas posibilidades, se analizó también la respuesta de las plantas KAT2as al tratamiento con SA. Como se observa en los análisis Northern de la figura 25.A y 25.C, la expresión inducida de PR1 en respuesta a Pseudomonas tanto en un contexto de II como de IC, y en respuesta al tratamiento exógeno con SA, fue similar en Col y en las dos líneas transgénicas KAT2as analizadas, indicando que una expresión reducida de KAT2 no afecta ni a la percepción del SA ni a la vía de transducción que activan la expresión de PR1, y que por tanto, KAT2 no interviene en la activación de la defensa dependiente de SA. Además, estos resultados evidenciaban por primera vez que, a diferencia de la ruta de síntesis descrita en solanáceas, KAT2 y por tanto la β-oxidación, no parecían intervenir en la biosíntesis de SA en respuesta a patógenos biotrofos en Arabidopsis, al menos con una participación significativa en la cantidad de SA producida.