HUMAN EFFORTS IN THE GLOBALIZATION PROCESS

Altres programes disponibles a la xarxa ens permeten predir, amb la cautela corresponent als resultats dels mètodes in silico, l’existència de nombrosos llocs de fosforilació al llarg de la seqüència peptídica d’USP25. Tanmateix, hem demostrat experimentalment que USP25m es fosforila en tirosines i en serines o treonines, d’una manera independent de la seva activitat enzimàtica, ja que tant la proteïna mutada al residu Cys catalític com la catalíticament activa, produeixen un patró similar.

És ben sabut que la fosforilació és una modificació posttraduccional capaç d’afectar la funció proteica en resposta a senyals externs (com ara estimulació mitjançant factors de creixement), o interns (com el dany al DNA). L’afectació de la funció pot ésser deguda a un canvi conformacional en el substrat que modifica l’activitat catalítica, o a la creació de superfícies d’interacció proteïna-proteïna que recluten proteïnes reguladores (Pawson i Scott, 2005). Fins ara s’ha descrit un altre cas d’enzim deubiqüitinant modificat per fosforilació: CYLD, un DUB específic de cadenes de poliubiqüitina enllaçades per Lys63 i que, en cas d’estar mutat, causa cilindromatosi familiar, es fosforila mitjançant la quinasa IKK. La fosforilació de CYLD desemboca en la seva inactivació (Reiley i col., 2005). Ara ens manca desentrellar l’efecte concret de la fosforilació en USP25, i les condicions fisiològiques en les quals es dóna.

Experimentalment, hem demostrat també que USP25m es pot acetilar, ubiqüitinar i sumoïlar. De la mateixa manera que la fosforilació, aquestes es donen independentment de l’activitat enzimàtica d’USP25m, ja que en fer servir el mutant catalític C178S, les modificacions no es veuen alterades. Remarcablement, però, la ubiqüitinació d’USP25m és molt més pronunciada en el mutant catalíticament inactiu C178S. Aquest resultat suggereix que la isoforma salvatge, amb la cisteïna activa, s’autodeubiqüitina, fet que dificulta la detecció de les formes ubiqüitinades. Experiments similars s’han realitzat amb l’enzim deubiqüitinant USP6 (Shen i col., 2005). En aquest cas, Shen i col·laboradors detectaren la presència d’una banda de pes molecular més elevat només en utilitzar una variant d’splicing que codificava per una isoforma més curta que no disposava del domini catalític (l’ús de la proteïna salvatge emmascarava els resultats degut a la pròpia autodeubiqüitinació de l’enzim). Van verificar els resultats gràcies a la construcció d’un mutant puntual on la cisteïna conservada va ser substituïda per una serina (equivalent al nostre mutant USP25 C178S).

L’autodeubiqüitinació com a mecanisme regulador no és sorprenent, tenint en compte que diverses E3s regulen els seus nivells i la seva activitat mitjançant la seva pròpia activitat Ub-lligasa. Aquest és el cas, entre d’altres, de l’autoubiqüitinació

de l’heterodímer format per les lligases BRCA1/BARD1 que, segons Chen i col·laboradors, enlloc de conduir a degradació, estabilitza el complex i intervé en vies de senyalització encara per determinar (Chen i col., 2002a). Nrdp1 (lligasa E3 que controla els nivells de ErbB3 i ErbB4 mitjançant ubiqüitinació per Lys48), en canvi, sí que regula els seus nivells per autoubiqüitinació. Curiosament, endemés, una de les proteïnes interaccionants amb Nrdp1 és USP8 que, mitjançant deubiqüitinació, afavoreix la seva estabilitat (Wu i col., 2004).

En el cas de l’autodeubiqüitinació d’USP6, cal esmentar que de no haver estat per l’ús d’una construcció catalíticament inactiva, Shen i col·laboradors no haurien detectat la ubiqüitinació d’aquest DUB. Tanmateix, aquest fet posa de manifest la subtilesa de les modificacions mitjançant Ub i la dificultat en la seva detecció. En la majoria de casos, un substrat ubiqüitinat constitueix un percentatge baix de la quantitat total de substrat. A més, en condicions fisiològiques, la ubiqüitinació és un fenomen altament dinàmic, on l’equilibri entre ubiqüitinació i deubiqüitinació està finament regulat per multitud de factors cel·lulars. El processament dels cultius cel·lulars per analitzar estats d’ubiqüitinació sovint requereix tractaments dràstics amb tampons de lisi, causant estressos irreversibles a les cèl·lules que dificulten, encara més, la detecció dels substrats ubiqüitinats. No és estrany, doncs, que a mesura que s’aprofundeixi en l’estudi dels mecanismes de regulació dels DUBs, es trobin més casos d’USPs que es modifiquin mitjançant ubiqüitinació. Els efectes d’aquestes modificacions, però, romanen encara incerts.

En els últims anys la llista de proteïnes multimodificades va augmentant ràpidament. Sembla que hi ha una correlació entre la multiplicitat dels llocs de modificació d’una determinada proteïna, la seva importància biològica i la complexitat de l’organisme (Yang, 2005). Segons aquesta hipòtesi, la funció que exerciria USP25 seria crucial a la cèl·lula, donades les seves nombroses modificacions posttraduccionals. De fet, ara s’obre un nou camp d’investigació, ja que s’hauria de provar l’efecte que tenen cadascuna d’aquestes modificacions en l’activitat enzimàtica, el reconeixement de substrats, la localització subcel·lular o la capacitat de dimerització (dades preliminars obtingudes per l’estudiant de doctorat Amanda Denuc mostren que USP25 és capaç de formar homodímers). Una altra contribució interessant seria determinar l’estat de modificació de la isoforma muscular d’USP25 al llarg de la miogènesi. De moment no sabem quina o quines són les formes actives, ni si les formes actives consten de les mateixes modificacions en els diferents teixits o estadis de diferenciació.

Tot i això, hem de tenir en compte que ens endinsem en un nou camp, ja que la rellevància fisiològica de les modificacions múltiples roman bastant incerta. És lògic pensar que l’ús combinat de la fosforilació, l’acetilació, la ubiqüitinació i la sumoïlació, entre d’altres, contribueix en un grau elevat en la complexitat biològica, potencialment exercint efectes de tipus “interruptor” o també de gradient. Tenint en

compte les possibles combinacions en funció del tipus de modificació i del residu modificat, apareixen nombroses isoformes que, potencialment, poden posseir una activitat i/o preferència de substrat diferent. Alguns autors comparen aquesta diversitat amb la generada per modificació posttranscripcional de l’mRNA (Pawson i Scott, 2005). En combinar ambdós tipus de modificacions, el nombre d’“isoformes proteiques” presents en un organisme augmenta exponencialment, explicant, en part, la gran complexitat fisiològica dels eucariotes superiors.