Hypotheses

de CXCL12 (B) y CXCR4 (C) en el hemisferio contralateral y en el ipsilateral de ratones con isquemia a distintos tiempos tras la inducción (isquemia). Como control de la expresión basal, las muestras con isquemia se compararon con los niveles expresados en ratones inyectados con Rosa Bengala pero sin inducir la isquemia (control). Las muestras fueron normalizadas respecto la expresión del ARN ribosómico 28S. Las barras representan la media y el error estándar de un experimento representativo de tres realizados independientemente.

Resultados

Estos resultados indican que en la evolución de la lesión causada en el modelo de infarto cerebral por fototrombosis se reproducen algunas de las características del modelo de infarto por oclusión de la arteria cerebral media: necrosis, edema y astrogliosis. Además, el aumento de la expresión de CXCL12 en el hemisferio ipsilateral, como consecuencia de la inflamación, parece indicar que el modelo de fototrombosis podría ser un modelo apto para estudiar la migración de NPC in vivo. Una vez puesto a punto y caracterizado el modelo, decidimos valorar las distintas vías de administración de NPC. Para ello, utilizamos dos vías de administración: vía intravenosa y vía intraparénquimal.

4.7.1.1.- Via intravenosa.

La vía intravenosa es una vía de administración menos invasiva que la vía intraparenquimal, no requiere de cirugía y se pueden inyectar volúmenes grandes y mayor número de células.

CD49d

Isopo

VLA-4

Núcleo Isquemia Cicatriz glial

Hemisferio contralateral Hemisferio ipsilateral CD3 1 A) B) 50 μm Figura 41. Vasos sanguíneos en el área periinfartada podrían soportar la extravasación de NPC. A) La expresión de VLA-4 en NPC se determinó por citometría de flujo con Ab anti-CD49d. Como control negativo se utilizó un anticuerpo inespecífico del mismo isotipo que el anti-CD49d. B) La presencia de vasos sanguíneos en el área periinfartada (centro) y en el núcleo isquémico (izquierda) se estudió por inmunofluorescencia con anticuerpo anti-CD31 (PE-CAM). A la derecha se muestra la presencia de vasos sanguíneos en una región equivalente pero en el hemisferio contralateral.

GFP+_-NSC

Transplante intravenoso Ratones con isquemia

(3 dpi) Hemisferio contralateral Hemisferio ipsilateral Digesón Enzimáca Citometría de flujo Análisis por microscopía Cortes histológicos

Figura 42. Esquema de la detección de NPC transplantadas vía intravenosa en el área periinfartada.

Se transplantaron en ratones con isquemia (3 días post-inducción) 5·106 _{células (NPC-GFP}+_{) vía}

intravenosa. Se estudió la llegada de las células a la zona periinfartada a distintos tiempos tras el transplante por citometría de flujo y por microscopía confocal.

Resultados

108

Papel de p110β en Migración de NPC in vivo

consecuencia de la inflamación, con lo que pensamos que podía ser un método sencillo y rápido para evaluar la migración de NPC a la lesión. Este método de transplante requiere de la adhesión de NPC en el lumen de los vasos sanguíneos como paso previo a la extravasación y entrada en el parénquima cerebral. Para ello, es necesario que las NPC expresen en su superficie integrinas que reconozcan moléculas de adhesión expresadas en las células endoteliales. El marcaje de NPC con anticuerpos específicos mostró que estas células expresan VLA4 (Fig. 41A), lo que asegura la posibilidad de interaccionar con sus ligandos en los vasos sanguíneos que se encuentran en los alrededores de la lesión (Fig. 41B).

Se indujo isquemia cerebral en ratones C57BL/6 y tres días post-isquemia, se inyectaron vía intravenosa 5·106 _{células NPC-GFP}+ _{aisladas de embriones (E14,5) transgénicos para GFP.}

La llegada de las células a la lesión se evaluó a distintos tiempos, según indicaba la bibliografía

(Bacigaluppi et al., 2009). El estudio de la llegada de las células se realizó por dos técnicas distintas en paralelo, análisis por citometría de flujo de homogeneizados de tejido nervioso, y por análisis histológico mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 42).

Este análisis requirió de la obtención de un homogeneizado de tejido mediante digestión enzimática, seguido de disgregación mecánica del tejido con lesión del hemisferio ipsilateral y de la región equivalente en el hemisferio contralateral (como control) en cada ratón. Dado que, según los datos de la bibliografía, esperábamos un bajo número de NPC, evaluamos si el método era suficientemente sensible (Bacigaluppi et al., 2009). Para ello, contaminamos el

Te

jido sin Isquemia (Homogenei

za do) + NPC-GFP (cells ) NPC GF P 0 2·10 2 2·10 3 2·10 4 FS FS FS FS FS

log SS GFP log SS log SS

1 2 3 4 Columna A B C D E Fil a

Figura 43. Puesta a punto de la detección de NPC-GFP+ _en

homogeneizados de tejido nervioso. Se diseccionó la

corteza cerebral de ratones sin isquemia. Mediante digestión enzimática y disgregación mecánica, se obtuvo el homogeneizado para el análisis por citometría de flujo. Fila A, muestra NPC-GFP+ _tratadas

en las mismas condiciones que el tejido para obtener el homogeneizado. Para determinar la sensibilidad de la citometría de flujo se contaminó homogeneizado de tejido nervioso con distintas cantidades de NPC-GFP+ _{(filas B 0; fila C}

2·102_{; fila D 2·10}3 _{y fila E}

2·104 _{células). Las células se}

identificaron en función de la fluorescencia de la GFP como muestra la columna

2 (recuadro). Los eventos

en negro representan NPC- GFP+ _{viables. La columna 3}

muestra las NPC-GFP+ _{que se}

observaban en el área recuadrada en la columna 2. La columna 4 muestra el solapamiento de los histogramas de los homogeneizados (columna 3 y filas C, D y E) con el histograma de las NPC-GFP+ _{(columna 3 y fila A).}

Resultados

homogeneizado de tejido infartadocon diluciones seriadas de NPC-GFP+_{, sometidas al proceso}

de homogenización, en paralelo, y evaluamos por citometría su presencia. El método demostró que la homogenización no afectó a la viabilidad de las células y que es posible detectar NPC- GFP+ _{incluso en condiciones de gran dilución (Fig. 43).}

A continuación, se indujo isquemia cerebral en ratones C57BL/6 y tres días post- isquemia se inyectaron 5·106 _{células NPC-GFP}+_{, evaluando la llegada de las células a la lesión}

Lo g10 (células de te ct adas ) 1 2 3 4 5

A)

B)

Figura 45. Detección de NPC-GFP+ _{en sangre tras 24}

h post-transplante. Puesta a punto de la detección

de NPC-GFP+ _{en sangre de ratones sin isquemia.}

Para ello, muestras de sangre se contaminaron con distintas cantidades de NPC-GFP+_{. Las muestras de}

sangre se procesaron con versalite para su posterior análisis por citometría de flujo. A) Histogramas representativos de muestras de sangre sin contaminar (izquierda) y sangre contaminada con 2·104 _células

(derecha). Los eventos fueron clasificados por tamaño y complejidad. Las células sanguíneas (eventos en gris) se diferenciaron de las NPC-GFP+ _en

base a la fluorescencia de la GFP (eventos en negro).