Identification of E faecium genes which are involved in lysozyme resistance

4.1.- Temperatura. Habitualmente, se utiliza una temperatura de 390C,

teniendo en cuenta que variaciones de tan solo 0,50C afectan seriamente a la capacitación (First y Parrish, 1988).

4.2.- pH. Para efectuar el lavado y la preincubación de los espermatozoides, el pH se mantiene a 7,4 (Parrish es’ aL, 1986; Fukui, 1990) o a 7,6 (Younis

eral., 1989), mientras que, durante el periodo de capacitación y en el medio de fecundación, se utiliza un pH de 7,4 (Younis es’ aL, 1989) o de 7,8 (Fukui e: al., 1989; Fukui, 1990), Este ha demostrado favorecer la eliminación de ciertas glicoproteinas decapacitantes que se encuentran en la superficie del espermatozoide (Cheng es’ al., 1986).

4.3.- Concentración espermática. Duranteel periodo depreincubación, para inducir la capacitación, la concentración espermática se mantiene entre 25 y 50 millones de esperm/ml (Lu es’ al., 1987; Fukui, 1990).

4.4.- Tiempo de capacitación. Los distintos autores indican un tiempo necesario distinto, según la metodología empleada, desde 4 horas (Panish es’ al., 1986) hasta las 18 horas de incubación, empleadas por Iritani es’ aL

(1984).

4.5.- Medios de capacitación. Su composición se basa en soluciones salinas que tienen una formulación química definida y sencilla (Yanagimachi, 1988). De acuerdo, también, con el método de capacitación seguido se utilizan varios medios: medio KRB-m (lritanies’ aL, 1984); medio DM-HIS (Brackett es’ al., 1982); medio TALP (medio Tyrode modificado con sales de HEPES, albúmina, lactato sódico y piruvato sódico; Parrish es’ al., 1986; Fukui,

En cuanto a algunos de los componentes de los medios, la mayor~ de ellos llevan una suplementación de B.S.A., que favorece la capacitación, ya que elimina colesterol y ácidos grasos de la membrana plasmática, los cuales impiden la capacitación (Go y Wolf, 1985) además de mantener ]a motilidad espermática.

Algunos autores no incluyen sales cálcicas, en los medios de lavado y capacitación espermática (Lu es’ al., 1987; First y Parrish, 1988), mientras que la presencia de glucosa en los medios de capacitación es controvertida. Parrish es’ al., (1986 y 1988) señalan que concentraciones de glucosa, superiores a 5 mM en el medio, inhiben la capacitación espermática inducida por la heparmna sódica. Según estos mismos autores, este hecho es similar a lo que ocurre itt vivo, ya que las concentraciones de glucosa en el oviducto bovino son muy pequeñas (del orden de 100 a 200 gM). Por ello, la mayoría de autores no utilizan concentraciones superiores a 5 mM de glucosa, en sus medios de capacitación, aunque Fukui (1990) señala que se puede aumentar la concentración de glucosa, siempre que se aumente también la de heparina como factor capacitante.

4.6.- Osmolaridad. La concentración iónica de los medios de capacitación varía desde valores de 380 mOsm/L en el medio DM-HIS (Brackett es’ al., 1982) hasta 290 mOsm/L en medios TALP (Parrish es’ aL, 1986).

4.7.- Variaciones individuales de los toros. Lamben es’ aL (1986) consideran un factor importante la posible variación entre los espermatozoides de los distintos toros que sc utilizan para la Ely. Eyestone y First (1989) señalan, sin embargo, que las verdaderas diferencias entre los distintos machos que se empleen para la FIV se ponen de manifiesto sólamente a partir del estadio de 4 células, durante el desarrollo embrionario temprano. En cualquier caso, la mayoría de los autores están de acuerdo en que la valoración cuidadosa de la fecundidad de los toros es importante al comenzar estudios relativos a la ElY y desarrollo embrionario (Gordon,

1990). En el caso del semen congelado, algunos autores utilizan pajuelas de varios toros (Parrish e: al., 1986) o emplean semen de un único toro de

fecundidad contrastada (Ohgoda el al., 1988; Fukui, 1990).

4.8.- Sustancias que favorecen la capacitación iii vit,o.

4.8.a. Glicosaminogilcanos (CAGs). Son polisacáridos unidos a proteínas. Los más importantes son el condroitín-sulfato, heparan-sulfato, el ácido hialurónico y la heparina. Lee y Ax (1984) señalan la existencia de altas concentraciones de CAOs en el oviducto bovino, los cuales se comportan como inductores, muy efectivos, de la capacitación y de la reacción acrosémica, tanto de los espermatozoides epididimales (Lenz e: al., 1983; Bali es’ al., 1983) como de los eyaculados (Parrish es’ al., 1986, 1988; Fukui, 1990; Rose y Bavister, 1992; Pavlov es’ aL, 1992). El glicosaminoglicano de mayor efectividad es la heparmna, debido a presentar un mayor grado de sulfatación y una elevada capacidad para unirse al espermatozoide (First y Parrish, 1988). La heparina induce la capacitación del espermatozoide por varios mecanismos (First y Parrish, 1987):

-Desplaza las proteínas decapacitantes de la membrana espermática.

-Estimula la apertura de los canales para el jón calcio, comportándose como un ionóforo.

-Activa la acción del AMP-c y de la fosfolipasa A2 (que aumenta la concentración de fosfolípidos, como la fosfatidilcolina, que, en pre~ncia de Ca2~ induce la reacción acrosómica). La heparina actúa en en este caso inmovilizando el ión Zn, que se comporta como inhibidor de la fosfolipasa A2.

La capacitación por heparina se inhibe en presencia de concentraciones superiores a 5 mM de glucosa, aunque este efecto es reversible si los espermatozoides se incuban con dosis de 200 gg/ml de heparmna o se añade AMPc (First y Parrish, 1988).

La mayoría de los autores que emplean espermatozoides, provenientes de eyaculado, utilizan heparina, ya que como indican First y Parrisb (1987, 1988) y Gordon (1990): “la utilización de heparina sódica ha demostrado ser el mejor método para inducir la capacitación y reacción acrosómica ha viti-o, en los espermatozoides bovinos”.

4.8 .b. Factores de mos’ilidad espermática. Diversos autores (revisado por Yanaginiachi 1988) indican la existencia de catecolaminas (epinefrina), varios aminoácidos (taurina, hipotaurina) y penicilamina, en el oviducto del hamster, cuyos niveles aumentan en los días del estro. Además, señalan que la adición de estas sustancias a los medios de capacitación favorecen la misma. Susko-Parrish et aL (1990) y Gordon (1990) señalan que la utilización de estos factores de motilidad presenta resultados satisfactorios, en el proceso de la FIV bovina.

4.8.c. Jons5foros para el calcio. BalI es’ al. (1983) suplementan el medio de capacitación con el ionóforo A-23 187, el cual tiene el efecto de abrir los canales del calcio y favorecer la capacitación de los espermatozoides bovinos.

4.8.d. Cafeína. Critser es’ aL (1986) indican que el uso de cafeína provoca una hipermotilidad espermática que, no obstante, no se traduce en un aumento de espermatozoides capacitados. Sin embargo, Coto es’ aL (1988) señalan lo contrario, destacando que la suplementación con 5 mM de cafeína, durante los periodos de lavado e incubación, aumenta el número de espermatozoides capacitados.

4.8.e. Nucleós’idos cíclicos. Algunos autores añaden AMPc a sus medios de 52

capacitación produciendo un efecto positivo, ya que la regulación del intercambio iónico, en la membrana del espermatozoide, está mediado por un mecanismo de fosforilación. En este mecanismo, interviene activamente la concentración intracelular de AMPc (Parrish et al., 1988). Otros autores sin embargo, indican que la adición exclusiva de AMPc, o sus derivados (8- Br-AMP), no aumenta las tasas de capacitación de espermatozoides bovinos (Critser e: aL, 1986).

4.81. Proteínas asociada al estro. Recientemente, Anderson e: aL (1992) han demostrado que cierta glicoproteina, presente en el oviducto bovino en el momento del estro (denominada EAP), favorece la capacitación, motilidad y aglutinación de los espermatozoides in vis’ro. La adición de esta proteína al medio favorece los indices de fecundación in viti-o (King e: aL, 1992).

4.8.g. Factor activador de las plaquetas (PAF). Parece ser que este factor incide positivamente en el conjunto de la capacitación, favoreciendo la reacción acrosómica y aumentando la motilidad de los espermatozoides bovinos (Fukuda y Roudebush, 1992).

4.9.- Células del cúmulo. Gwatkin es’ al.> (1972) señalan que la presencia de las células del cúmulo juega un papel fundamental en la capacitación de espermatozoides de hamster itt viti-o. En la especie bovina, el efecto de las células del cúmulo ha sido evaluado respecto al conjunto del sistema maduración/fecundación itt viti-o teniendo en cuenta el efecto del cúmulo sobre la propia maduración del oocito y sobre los fenómenos de capacitación (Critser e: aL, 1986; Thibault es’ aL, 1987; Shioya es’ aL, 1988). Específicamente, Fukui (1990) indica que la zona pelúcida de los oocitos, con cúmulo o denudados, es capaz de inducir la reacción acrosómica. El mismo autor señala que los índices de espermatozoides capacitados y reaccionados aumentan, significativamente, cuando los oocitos están completamente rodeados de las células del cúmulo, respecto a los oocitos denudados.