Los RR se encuentran en el final de las vías de fosfotransferencia, donde regulan la respuesta efectora, activados por la fosforilación. La mayoría de los RR posee una estructura de dos dominios: un dominio regulatorio N-terminal conservado y un dominio efector C-terminal variable. La fosforilación de un residuo Asp conservado en el dominio regulatorio resulta en un cambio conformacional creando un RR activo, capaz de permitir una respuesta intracelular, usualmente la expresión génica (48). Entre las proteínas de señalización, los RR son únicos en utilizar la fosforilación de un Asp para la regulación.
El dominio regulatorio es un dominio conservado, constituido por un plegamiento conservado (α/β)5 que consiste en cinco láminas β paralelas centrales
flanqueadas en ambas caras por hélices α anfipáticas. Este dominio cataliza la transferencia de un grupo fosforilo desde un residuo His conservado en la HQ asociada a uno de sus propios residuos Asp, localizado dentro de un bolsillo acídico expuesto en su superficie. El dominio regulatorio sufre cambios estructurales dinámicos con la fosforilación, pasando desde una conformación inactiva a una activa (30). La activación resulta en sutiles cambios conformacionales que se localizan primeramente en la cara α4-β5-α5 de la superficie del dominio regulatorio (79, 80).
Consecuentemente, diferentes zonas de esta interfase influyen en los dominios efectores asociados, ya sea por interacción directa (81–83) o por formación de dímeros (84). La proteína quimiotáctica que carece de dominio efector, CheY, ha servido como modelo representativo de los dominios regulatorios de los RR (85).
Estos dominios conservados no son componentes pasivos en la fosfotransferencia desde las HQ o los dominios HPt, sino que catalizan la transferencia del grupo fosforilo. Esto se evidenció a partir de la capacidad de
pequeñas moléculas dadoras de fosfato como el acetil-fosfato o el fosfamiridato, de sustituir a la HQ en ensayos de fosfotransferencia in vivo e in vitro (86–88). El hecho de que el grado de fosfotransferencia desde los residuos His y los dominios HPt de las HQ fuera mayor que desde las moléculas dadoras de fosfato, sugirió la existencia de un alineamiento apropiado del grupo fosforilo debido a un reconocimiento de determinantes en ambos componentes que promovería la fosfotransferencia.
Una pregunta central en el mecanismo de señalización es cómo la función del dominio efector es modulada por la fosforilación del dominio regulatorio. Estudios genéticos, bioquímicos y biofísicos han permitido determinar la estructura de diferentes dominios regulatorios de RR fosforilados o activados. Estos estudios han confirmado la noción que la fosforilación del Asp en el sitio activo provoca pequeños reposicionamientos de la estructura secundaria ligados a una reorientación de un grupo de cadenas laterales específicas, llevando a una modificación estructural que se propaga a través de la molécula (48, 89, 90).
Las diferencias estructurales entre el dominio regulatorio defosforilado y fosforilado afectan una gran superficie del RR y varían en los diferentes RR, en cuanto a magnitud y superficie alterada. Sin embargo, en todos los casos los cambios estructurales se propagan casi exclusivamente a la mitad C-terminal del dominio regulatorio y la superficie que sufre la alteración estructural corresponde a superficies que participan en la interacción proteína-proteína. Estos y otros datos avalan la hipótesis de que los RR existen en equilibrio entre dos conformaciones predominantes, correspondientes a los estados activo e inactivo. La fosforilación lleva el equilibrio hacia una conformación activa. La activación altera la gran superficie molecular del dominio regulatorio, parte de la cual dictamina interacciones proteína- proteína específicas, que median la respuesta efectora. Además, existe gran versatilidad en el modo en que ese cambio conformacional regula la actividad del dominio efector. En algunos casos, la fosforilación promueve la dimerización que es requerida para la unión al ADN, aumenta la unión al ADN en ausencia de dimerización o es requerida para una interacción productiva con la maquinaria transcripcional. En otros RR, la fosforilación induce un cambio conformacional que libera un efecto autoinhibitorio o puede modificar su capacidad de interacción con otras proteínas (53, 91).
Los dominios efectores son de estructura y función diversa, dictando a su vez una gran variedad de respuestas efectoras mediante diferentes mecanismos para regular sus actividades.
La función más comúnmente observada de los RR es la de regular la expresión génica. La gran mayoría de los RR son factores transcripcionales que pueden dividirse en tres subfamilias en base a la homología del extremo C-terminal de unión al ADN del dominio efector. Estas subfamilias son designadas según miembros representativos de cada una: OmpR (plegamiento del tipo hélice-giro-hélice, HTH “alado”) (92); NarL (dominios con cuatro hélices α característico) (81); y NtrC (dominio de unión a ATP cuya actividad ATPasa se requiere para su unión al ADN) (93). A pesar de existir plegamientos comunes, las interacciones con la maquinaria transcripcional y los mecanismos de activación difieren dentro de cada subfamilia.
Además de los RR con dominios de unión al ADN se ha descripto el RR AmiR de
Pseudomonas aeruginosa con un dominio de unión a ARN (94). El dominio efector puede incluso estar en otra proteína o complejo de proteínas, como en el caso de CheY. Esta proteína es un RR asociado a la quimiotaxis que carece de un dominio efector y une el componente del motor flagelar FliM, produciendo una modificación en el sentido de giro del flagelo bacteriano (95). Algunos pocos RR poseen dominios efectores con funciones enzimáticas. Estos reguladores combinan el dominio N-terminal fosfoaceptor del tipo CheY con dominios metilesterasa, como CheB (96), con dominios GGDEF y EAL con actividad diguanilato ciclasa y fosfodiesterasa, respectivamente (97), u otros con potenciales actividades enzimáticas aún desconocidas (63).
Los rearreglos estructurales de las HQ sensoras en la unión del ligando y los cambios conformacionales inducidos por la fosforilación de los RR forman parte de un mecanismo fundamental para la propagación de la señal dentro de las células. A pesar de que el mecanismo de fosfotransferencia es común a todos los sistemas de dos componentes, la versatilidad de estos sistemas es resultado del diseño modular y la regulación multifacética del estado fosforilado de los RR.
INT. 4. El sistema de dos componentes PhoP/PhoQ de Salmonella
El sistema ortodoxo de dos componentes PhoP/PhoQ de S. Typhimurium está conformado por la proteína PhoQ, un sensor transmembrana con actividad bifuncional histidina quinasa/fosfatasa, y el regulador de respuesta PhoP (98).
La histidina quinasa PhoQ se encuentra formando un dímero en la membrana interna bacteriana. Posee dos regiones transmembrana, resultando en un dominio sensor periplásmico y un dominio citoplásmico. El dominio citoplásmico contiene un subdominio linker HAMP próximo a la membrana, un sitio conservado de autofosforilación (caja H en el subdominio DHp) y un dominio C-terminal que une ATP para llevar a cabo las actividades quinasa y fosfatasa (subdominio CA). En respuesta a señales ambientales específicas, la proteína se trans-autofosforila dentro del dímero en un residuo His conservado en el dominio citoplásmico, y el fosfato es subsecuentemente transferido a un residuo Asp en el regulador de respuesta PhoP. PhoP fosforilada se une al ADN para controlar la expresión de los denominados genes activados (pag) o reprimidos (prg) por PhoP (99). La fosforilación promueve la unión de PhoP a sitios de unión en tándem denominados caja PhoP, que consisten en dos repeticiones directas de la secuencia (G/T)GTTTA(A/T) separada por cinco nucleótidos, localizada entre 25 y 42 bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción (100).
La proteína PhoQ es un sensor para Mg2+ extracelular (101). El crecimiento de
la bacteria en un medio con una concentración milimolar de Mg2+ reprime la
transcripción de los genes activados por PhoP, mientras que el crecimiento en concentraciones micromolares del catión resulta en la transcripción de los mismos.
Este TCS es un regulador maestro de la virulencia de S. Typhimurium. El regulón controlado por este TCS incluye genes que son críticos para la homeostasis de Mg2+ (99) y aquellos que provocan modificaciones en el LPS, lo que determina la
susceptibilidad de la bacteria a péptidos catiónicos antimicrobianos (99, 102–104). El sistema PhoP/PhoQ también está involucrado en el mecanismo de ingreso de la bacteria a la célula del hospedador, modulando la expresión del inyectisoma y de los efectores translocados (105–107). Una vez dentro de la célula, los genes regulados por PhoP contribuyen a definir la sobrevida intracelular de Salmonella, estando
implicados en la capacidad de proliferación intravacuolar de la bacteria y en el tráfico divergente de la SCV de la vía endocítica canónica (108–110).
El hallazgo de la importancia del locus phoPQ en la virulencia de Salmonella se remite a experimentos efectuados por Fields y cols. (10, 111), quienes detectaron mutantes transposicionales incapaces de sobrevivir en macrófagos y demostraron que éstas poseían una muy alta dosis letal media (LD50) en ratones. Se encontró además, que estas mutantes eran sensibles a extractos de gránulos provenientes de neutrófilos humanos, macrófagos de ratón y a péptidos antimicrobianos. Éstas mutaciones fueron mapeadas en el locus phoP (111), originalmente descripto por Kier y cols. (112).
El locus phoPQ se encuentra presente tanto en bacterias Gram negativas patógenas como no patógenas (113, 114). Si bien fue primero analizado en profundidad en S. Typhimurium, todos los sistemas PhoP/PhoQ analizados funcionalmente hasta el momento respondieron a variaciones en las concentraciones de Mg2+ extracelular y estuvieron involucrados en distintas vías de virulencia en
patógenos bacterianos. En P. aeruginosa, una mutación en phoQ provoca una disminución en la citotoxicidad en células epiteliales humanas y una disminución en la sobrevida en infecciones pulmonares crónicas en ratas (115). Por otro lado, se ha demostrado la importancia de PhoP en la sobrevida de Yersinia pestis dentro de macrófagos (116).
Las cepas de S. Typhimurium que poseen deleciones en los genes phoP o phoQ
muestran deficiencias en su virulencia: su dosis letal media en ratones BALB/c inoculados intraperitonealmente es cinco órdenes de magnitud mayor que la cepa salvaje, son incapaces de sobrevivir en macrófagos y presentan una susceptibilidad aumentada a péptidos microbicidas, sales biliares y pH ácido (10, 117, 118).
La mutante constitutiva denominada pho24 induce una sobreeexpresión de los genes activados por PhoP y una represión de los genes reprimidos por PhoP. Esta mutante posee un único cambio de nucleótido que resulta en una sustitución aminoacídica del residuo de treonina 48 por isoleucina, correspondiente al dominio periplásmico del sensor PhoQ (119, 120). Es interesante el hecho que la mutante constitutiva pho24 exhibe varios fenotipos de virulencia descriptos para la mutante nula phoP. Además, tiene disminuida su capacidad de invadir células no fagocíticas
debido a la represión de varios genes de la SPI-1 (121), y es deficiente en la inducción de la formación de vacuolas espaciosas en macrófagos (122). Estos resultados indican que la simple activación de los genes activados por PhoP no es suficiente para la virulencia, sino que es necesaria una regulación espacial o temporal de su expresión.