4.1 Localización
El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Genética Molecular Vegetal, en la Unidad de Bioinformática y Biología Computacional del Centro de Biotecnología y Bioindustria CBB, de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA), sede Tibaitatá. Esta tesis, formó parte del proyecto “Evaluación de resistencia o tolerancia de germoplasma de uchuva (Physalis peruviana) a Fusarium oxysporum como contribución al control integrado de la enfermedad” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR), código 072-2008L4787-3281.
4.2 Material vegetal
Para este estudio, se usó material foliar, de la accesión 09U216-6, perteneciente a la colección del Banco de Germoplasma de uchuva, administrado por CORPOICA. Según datos de pasaporte, este material pertenece al ecotipo Colombia, seleccionado a partir de cultivos comerciales del departamento de Nariño. En estudios previos, la accesión usada fue catalogada como susceptible a F. oxysporum en condiciones de invernadero y campo (González & Barrero, 2011). Adicionalmente, el ecotipo fue caracterizado a nivel citogenético, mediante conteo cromosómico y citometría de flujo, dando como resultado un nivel de ploidía de 2n=4x=48, con un tamaño de genoma haploide o valor C de 1.93pg de ADN (1.8Gpb) (Liberato, 2012).
4.3 Extracción de ARN y construcción de la librería normalizada de ADNc
Para la síntesis de ADNc, se colectó material vegetal foliar de 6 clones del ecotipo seleccionado, proveniente de condiciones in vitro. El tejido fue conservado en nitrógeno líquido y enviado a Bio S&T Inc. (Montreal, QC, Canadá) donde se realizó la extracción de ARN, síntesis de ADNc y normalización de la librería. El ARN total, fue sintetizado usando el método de TRIzol modificado (Invitrogen, 2010). La síntesis de ADNc se realizó a partir de 16g de ARN total purificado, mediante el método de síntesis de ADNc SMARTTM (Clontech, USA), modificado. Este protocolo se basa en capacidad de la enzima transcriptasa reversa (RT, siglas en Inglés), de transcribir ARNm en ADNc de
doble cadena y el uso del oligonucleótido SMART IV (en inglés - Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript) para producir ADNc completo (Zhu et al., 2001).
Una vez sintetizado el ADNc, se realizó la normalización de la librería, usando el método de normalización modificado de Patanjali et al. (1991) y Soares et al. (1994). Este proceso, tuvo como fin igualar el número de copias de genes en la librería, reduciendo la prevalencia de transcritos abundantes, equiparándolos a la concentración de transcritos que se expresan en un bajo nivel (Bogdanova et al., 2011). El procedimiento general, consistió en la síntesis de ADNc completo ligado a dos pares de adaptadores tester3/tester5 fosforilado y driver3/driver5 fosforilado (Anexo 1) para la muestra prueba (tester) y la muestra de referencia (driver). El ADNc de cadena sencilla fue usado para la hibridación en lugar del ADNc de cadena doble. De esta manera, se realizó una digestión con la enzima exonucleasa lambda (), la cual permitió la degradación de las cadenas con el extremo 5’ fosforilado. Posteriormente, las hebras sencillas tanto del tester como driver, fueron sometidas a hibridación; así, los transcritos que se presentaron en exceso fueron hibridados entre sí. Después, las moléculas con cadena doble fueron separadas de la sencilla usando cromatografía en hidroxiapatita. Las moléculas de ADNc normalizadas, de cadena sencilla, fueron amplificadas con el cebador L4N, específico para el tester (FailSafeTm PCR system, Epicentre Biotechnologies, USA). Finalmente, se realizaron cortes de los fragmentos de ADNc amplificados en geles de agarosa al 1% y se seleccionaron fragmentos mayores a 0.5kb, los cuales fueron purificados por electro-elución y almacenados en 80% de EtOH a -80ºC.
4.4 Secuenciación y ensamblaje
La librería de ADNc normalizada, fue secuenciada mediante la técnica de secuenciación de segunda generación pirosecuenciación ó 454 - GS FLX Titanium de Roche, en el Centro Genómico de Emory (Atlanta, GA, USA). Aproximadamente, 5 μg de ADNc purificado fue fragmentado mediante el sistema Covaris E210, y posteriormente secuenciado en tres cuartos de placa de 454. Mediante esta técnica se generaron archivos tipo SFF (Standard Flowgram File), que contienen las secuencias con sus respectivos valores de calidad, los cuales fueron sometidos al NCBI Sequence Read Archive (SRA) (número de accesión SRP005904).
Los archivos SFF, fueron convertidos a archivos tipo FASTA mediante el comando sffinfo (Roche, 2010), con el fin de usar el script SeqClean (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software/), basado en el algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990), antes y después del ensamblaje. SeqClean permitió realizar limpieza de adaptadores, colas polyA, secuencias de baja calidad y secuencias con una longitud mínima y máxima de 50pb y 600pb. Una vez realizado el proceso de limpieza, se
generaron nuevamente archivos tipo SFF, los cuales fueron usados para realizar un ensamblaje de novo, mediante el software Newbler, GS de novo Assembler (Roche, versión 2.5.3), usando los parámetros por defecto. Adicionalmente, se llevó a cabo un ensamblaje comparativo con el genoma borrador de papa (Solanum tuberosum – versión PGSC_DM_v3) (X. Xu et al., 2011) y el genoma borrador de tomate (Solanum
lycopersicum – versión ITAG2.3)
(http://solgenomics.net/organism/solanum_lycopersicum/genome), utilizando GS Reference Mapper de Newbler.
En el ensamblaje de novo, newbler ensambló las lecturas en contigs, los cuales fueron posteriormente ensamblados en isotigs. Los isotigs, representan transcritos alternativos putativos de un gen, agrupados en isogrupos si comparten contigs entre ellos. Las lecturas que no ensamblaron dentro de un contig se definieron como singletons. El ensamblaje fue depositado en la base de datos Transcriptome Shotgun Assembly (por sus siglas en inglés, TSA) del NCBI, con números de accesión JO124085-JO157957.
4.5 Anotación Funcional
A partir del ensamblaje de novo, se realizó un BLASTX de los isotigs y singletons (unigenes) contra la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot (versión Abril-2011). Se usó un valor esperado “e-value” de 1e-5 y se recuperó el mejor alineamiento para cada isotig, mediante el uso de los parámetros -num_descriptions y -num_alignments, a partir del formato de salida en XML. Aquellos unigenes que no presentaron homología con una proteína de la base de datos de UniProtKB/Swiss-Prot, fueron comparados contra la base de datos RefSeq del NCBI (versión 47).
La salida de BLAST en formato XML, fue usada para realizar la anotación funcional utilizando el paquete Blast2GO (versión 2.4.8) (Conesa et al., 2005), usando los parámetros por defecto. Este programa extrajo los términos ontológicos (GO) más significantes, de los resultados obtenidos por BLAST para cada secuencia. Adicionalmente, el programa asoció las secuencias a códigos enzimáticos (EC, siglas en Inglés) y rutas metabólicas en la cual cada una de ellas participa, mediante el uso de la base de datos KEGG-PATHWAY (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Finalmente, se realizó un rpsblast de los unigenes contra la base de datos CDD (Conserved Domain Database) (Marchler-Bauer et al. 2011), para la identificación de dominios protéicos, usando un e-value de 1e-5 y seleccionado aquellos hits con una longitud de alineamiento mayor a 2/3 de la longitud del dominio identificado.
4.6 Identificación de marcadores moleculares
Se identificaron marcadores tipo microsatélite (SSRs) en la colección de contigs obtenida a partir del ensamblaje de novo realizado, mediante el programa Phobos (versión 3.3.10) (Mayer, 2006-2010). Se identificaron marcadores tipo perfecto e imperfecto, con una longitud mínima de 18pb para dinucleótidos, 24pb para trinucleótidos y tetranucleótidos, 30pb para pentanucleótidos y 36pb para hexanucleótidos. El anexo 2 representa gráficamente el flujo de trabajo realizado en este estudio.
4.7 Organización de la información en una base de datos
Se generó una base de datos (BD) con la información principal obtenida en este trabajo (BLAST, secuencias y ontologías), la cual fue almacenada en un servidor MySQL (versión 5.5.16). Los datos fueron cargados a la BD a partir de archivos en formato de texto plano. Finalmente, la base de datos fue enlazada a una página web, desarrollada por Parra (2011), mediante un script en PHP y además fue actualizada como parte de este proyecto.