Impact of information systems

Para poder realizar las inmunocitoquímica de las células, éstas se siembran sobre cubreobjetos. Se esterilizan los cubreobjetos con etanol hasta su evaporación y posteriormente se incuban con una solución de PBS 1X-0,1% gelatina durante 30 min. a 37ºC. Una vez eliminada la solución de gelatina, se siembran los EBs sobre los cubreobjetos y al final de los protocolos de diferenciación se lavan con PBS 1X (3 veces). Después, las células se fijan con paraformaldehído (PFA) 4%-PBS 1X durante 20 min. y se lavan con PBS 1X (3 veces). Se conservan en PBS-0,1% acida sódica a 4ºC.

9.1 INMUNOCITOQUÍMICA MEDIANTE MÉTODOS ENZIMÁTICOS

Se ha utilizado para las inmunocitquímica el método enzimático HRP (Horseradish Peroxidase). Se usó un kit comercial, DAKO Liquid DAB+ Substrate- Chromogen System de DAKO, según el siguiente protocolo:

• Permeabilizar con PBS 1X-Tritón 0,1%-Saponina 0,1% durante 45 min. • Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Bloquear la peroxidasa endógena con la solución comercial de DAKO, que contiene H2O2, durante 2 min.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Bloquear las interacciones inespecíficas con una solución de PBS-BSA 1%- Saponina 0,1% durante 45 min.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Incubar con el anticuerpo primario en PBS 1X-BSA 1%-Saponina 0,1% durante 1 hora y 30 min.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Incubar con el anticuerpo secundario en la solución Envision plus (del kit comercial) durante 30 min.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Añadir la solución de revelado de la peroxidasa de rábano (HPR) con la solución del kit comercial de sustrato y cromógeno (DAB, diaminobenzidina).

• Incubar la reacción entre 2 y 15 min.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Contrateñir con una solución de hematoxilina-eosina. • Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Lavar tres veces con H2O durante 2 min.

• Montar las muestras sobre portaobjetos en medio acuoso (Aquatex).

9.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

• Incubar con NH4Cl 50 mM 5 min.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Permeabilizar con PBS 1X-Tritón X-100 0,2% durante 5 min. • Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Incubar con la solución de bloqueo PBS-BSA 1% durante 30 min. para evitar uniones inespecíficas del anticuerpo.

• Incubar con el anticuerpo primario en PBS-BSA 1% entre 1 hora y 30 min. a TA u O/N a 4ºC.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 10 min.

• Incubar con el anticuerpo secundario unido a fluoresceína (FITC) a una dilución 1:40 en PBS-BSA 1%, durante 1 hora. A partir de este paso, el protocolo se realiza manteniendo las muestras en oscuridad.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Teñir los núcleos con To-pro3 (1 μM) diluido en PBS 1X, durante 5 min. • Lavar tres veces con H2O.

• Montar las muestras sobre portaobjetos con mowiol. • Conservar las muestras a 4ºC en oscuridad.

9.3. INMUNOFLUORESCENCIA MEDIANTE AMPLIFICACIÓN CON EL MÉTODO TSA

Para realizar las inmunofluorescencias con sistemas de amplificación se ha usado el kit comercial TSATM Fluorescente Systems Tyramide Signal Amplification de

unido a biotina que a su vez será reconocido por la estreptavidina acoplada a HRP, y finalmente el fluorocromo unido a tiramida se deposita donde está la HRP inmovilizada.

• Permeabilizar con metanol 60% disuelto en H2O durante 30 min. • Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Bloquear la peroxidasa endógena con el reactivo de bloqueo comercial durante 2-3 min.

• Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Añadir la solución de bloqueo comercial (TNB) durante 45 min. para evitar uniones inespecíficas del anticuerpo.

• Incubar el anticuerpo primario en PBS-BSA 1%-saponina 0,1% durante 1 hora y 30 min.

• Lavar sucesivamente con PBS 1X durante 10 min., PBS 1X-Tween 0,2% durante 5 min. y PBS 1X durante 10 min.

• Incubar el anticuerpo secundario acoplado a biotina diluido en TNB a 1:350, durante 45 min.

• Lavar en PBS 1X durante 10 min., PBS 1X-Tween 0,2% durante 5 min. y PBS 1X durante 10 min.

• Incubar con estreptavidina/HRP diluida en TNB a 1:200, durante 35 min. • Lavar sucesivamente con PBS 1X durante 10 min., PBS 1X-Tween 0,2% durante 5 min. y PBS 1X durante 10 min.

• Incubar el fluorocromo, cianina 3, unido a tiramida (el cual se diposita donde hay peroxidasa) diluido en el diluente amplificador a 1:100, durante 5 min. A partir de este paso el protocolo se realiza manteniendo las muestras en oscuridad. • Lavar tres veces con PBS 1X durante 5 min.

• Teñir los núcleos con To-pro3 (1μM) diluido en PBS 1X, durante 5 min. • Lavar tres veces con H2O.

• Montar las muestras sobre portaobjetos con mowiol. • Conservar las muestras a 4ºC en oscuridad.

9.4. INMUNOFLUORESCENCIA PARA LA DETECCIÓN DE BROMODIOXIURIDINA (BrDu)

• Lavar las células con PBS 1X tres veces. Tripsinizar las células, contarlas y preparar una suspensión monocelular de 1·106 células por punto. Al ser una suspensión celular, después de cada paso, para eliminar las soluciones de trabajo se centrifugan las células 3 min. a 1000 rpm, y al añadir cada solución nueva es necesario pipetear bien las células para volver a resuspenderlas.

• Incubar las células con el fijador citofix del kit comercial Cytofix/Cytoperm de BD Company durante 20 min. a 4ºC.

• Lavar las células con tampón de lavado del kit comercial Cytofix/Cytoperm tres veces durante 5 min.

• Desnaturalizar el DNA. Para ello se usa una solución de desnaturalización que se prepara al momento y contiene 0,5% BSA-2M HCl en PBS 1X. Esta solución se deja precipitar durante unos min. antes de ser usada. Se incuban las células con esta solución durante 20 min. a TA.

• Lavar las células con PBS 1X tres veces durante 5 min.

• Incubar con la solución de bloqueo PBS 1X-BSA 0,5%-Tween 0,5% durante 30 min.

• Incubar con el anticuerpo primario anti-BrDu diluido en la solución de bloqueo a 1:2000, durante 45 min.

• Lavar las células con PBS 1X-BSA 0,5%-Tween 0,5% tres veces durante 5 min.

• Incubar el anticuerpo secundario unido a fluoresceína diluido en la solución de bloqueo a 1:200. A partir de este punto se mantienen las células en oscuridad. • Lavar las células con PBS 1X tres veces durante 5 min.

• Incubar con ioduro de propidio 5μg/ml y RNAsa A 150 μg/ml en PBS O/N a 4ºC.

9.5. ANTICUERPOS UTILIZADOS EN ESTE ESTUDIO

Marcador Anticuerpo Origen Dilución

WB

Dilución ICQ Pdx-1 Conejo (policlonal) Dr. F.X.Real 1:2500 1:300 p48 Conejo (policlonal) Dr. F.X.Real 0,5 μg/ml 5 μg/ml Mist-1 Ratón (monoclonal) Dr. Konieczny 1:500 1:2 Amilasa Conejo (policlonal) Sigma 0,5 μg/ml 10 μg/ml Carboxipeptidasa Conejo (policlonal) Biogenesis 1:6000 1:1500 Quimiotripsinógeno Ratón (monoclonal) Biogenesis X 1:1000 E-cadherina Ratón (monoclonal) Trans. Lab. X 1:500

β-catenina Ratón (monoclonal) Trans. Lab. X 1:500 Sintaxina-4 Conejo (policlonal) Synaptic Systems X 1:1500 CCKAR Conejo (policlonal) Euro-Diagnostica X 1:2500

VAMP-8 Conejo (policlonal) Abcam X 1:500

BrDu Ratón (monoclonal) BD Biosciences X 1:2000

Ig-FITC Ratón Dako Cytomation X 1:40

Ig-FITC Conejo Dako Cytomation X 1:40

Ig-HRP Ratón Dako Cytomation 1:2000 1:200

Ig-HRP Conejo Dako Cytomation 1:2000 1:200

Ig-Biotina Ratón Dako Cytomation X 1:350

Ig-Biotina Conejo Dako Cytomation X 1:350

Tabla 2.25: Anticuerpos usados en el estudio. WB = Western Blot; IF= Inmunofluorescencia; HM = autoproducción (home made).